陳裕華，朱建翠，沈 丹，楊建宇，于 飛，何日文

（廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東廣州 510440）

禽流感病毒是正粘病毒科流感病毒屬單鏈負股RNA病毒[1]。禽流感病毒亞型眾多，病毒表面糖蛋白血凝素（HA）有16種（H1－H16），神經(jīng)氨酸酶（NA）有9種（N1－N9）。HA和NA的抗原變異是相互獨立的，各亞型之間缺乏交叉保護，同一亞型病毒有不同的變異株[2]。高致病性禽流感是A型流感病毒引起的以感染禽類為主的烈性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。

目前，各國采取的禽流感預(yù)防和控制措施各不相同。我國采用免疫和撲殺相結(jié)合的防控策略。疫苗免疫仍是我國當(dāng)前預(yù)防高致病性禽流感的重要手段。2005年我國開始實施H5N1亞型高致病性禽流感全面免疫政策。此后至今，疫苗毒株從Re-1株、Re-4株、Re-5株、Re-6株、Re-8株，更替到現(xiàn)在的Re-10株[3]。2017年1月，對雞具有高致病性的H7N9變異株被證實，3月24日農(nóng)業(yè)部公布了我國第一起蛋雞H7N9高致病性流感疫情。2017年7月7日，農(nóng)業(yè)部辦公廳下發(fā)《農(nóng)業(yè)部關(guān)于切實做好全國高致病性禽流感秋季免疫工作的通知》（農(nóng)辦醫(yī)〔2017〕24號），要求各地在2017年秋季統(tǒng)一用重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）（以下簡稱“H5+H7”二價滅活疫苗）替代重組禽流感病毒H5二價或三價滅活疫苗，對家禽實施免疫[4]。為更好地了解家禽H7N9流感的免疫效果，廣州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所開展了田間 “H5+H7”二價滅活疫苗免疫效果評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 肉雞（江村黃雞）、櫻桃谷白鴨、黑棕鵝（以下分別簡稱雞、鴨、鵝）各120只。在選定的養(yǎng)殖場按常規(guī)方法飼養(yǎng)至出欄。

1.1.2 試驗疫苗 “H5+H7”二價滅活疫苗（批號2017014）：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測試劑 禽流感H5N1亞型HI試驗抗原和陽性血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；H7亞型HI試驗抗原和陽性血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 雞9日齡首免，劑量0.3 mL，30日齡二免，劑量0.5 mL；鴨15日齡首免，劑量1.0 mL；鵝15日齡首免，劑量1.0 mL，50日齡二免，劑量1.5 mL（表1）。

表1 家禽重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫程序

1.2.2 母源抗體測定 對雞、鴨、鵝，分別于9日齡、15日齡和15日齡，各采集血清10份測定母源抗體。

1.2.3 采集活禽咽肛拭子及血清 隨機選取一定數(shù)量的活禽，采集每只家禽咽喉、泄殖腔棉拭子各1個，放入事先加入1 mL PBS液的離心管中，咽肛棉拭子與血清一一對應(yīng)。采集雞、鴨、鵝咽肛拭子及血清的時間點和樣品量詳情見表2。咽肛拭子?70 ℃保存待檢，血清?20 ℃保存待檢。

1.2.4 HI抗體效價測定 按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗技術(shù)進行。用H5N1亞型HI試驗抗原和陽性血清檢測H5抗體，用H7亞型HI試驗抗原和陽性血清檢測H7抗體。HI效價≥4 log2判定為合格。

表2 活禽咽/肛拭子及血清采集情況 單位：份

1.2.5 填寫“免疫后臨床觀察表” 免疫后需每日填寫禽群的采食量、精神狀況、發(fā)病與死亡情況、注射部位有無異常等信息。

1.2.6 數(shù)據(jù)整理和分析 對檢測結(jié)果用Excel、

SPSS 20.0等軟件，進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 母源抗體測定情況

9日齡雞的H5和H7母源HI抗體效價幾何平均值（GMT）分別為7.3 log2和1.0 log2，15日齡鴨的H5和H7母源HI抗體效價GMT分別為3.3 log2和0，15日齡鵝的H5和H7母源HI抗體效價GMT分別為2.3 log2和0.3 log2（表3）。

表3 實驗動物母源抗體測定情況

2.2 免疫效果監(jiān)測情況

2.2.1 免疫雞群的HI抗體水平 試驗結(jié)果顯示：首免后21 d，免疫雞群H5亞型HI抗體效價均值為4.2 log2，抗體合格率為66.67%，30日齡加強免疫后14～70 d（出 欄），HI效價平均值為8.0～9.0 log2，抗體合格率為100%；首免后21 d，免疫雞群H7亞型HI抗體效價平均值為7.5 log2，抗體合格率為100%，30日齡加強免疫后14～70 d（出欄），HI效價平均值為8.2～9.0 log2，抗體合格率為100%（圖1）。

圖1 雞免疫抗體HI效價變化

2.2.2 免疫鴨群的HI抗體水平 試驗結(jié)果顯示：首免后21 d，免疫鴨群H5亞型HI抗體效價平均值為5.1 log2，抗體合格率為86.67%，首免后32 d，HI效價平均值為6.1 log2，抗體合格率為100%；首免后21 d，免疫鴨群H7亞型HI抗體效價平均值為5.6 log2，抗體合格率為100%，首免后32 d，HI效價平均值為6.4 log2，抗體合格率為100%（圖2）。

圖2 鴨免疫抗體HI效價變化

2.2.3 免疫鵝群的HI抗體水平 試驗結(jié)果顯示，首免后21 d，免疫鵝群H5亞型HI抗體效價平均值為3.9 log2，抗體合格率為53.33%，50日齡加強免疫后14～70 d（出欄），HI效價平均值為7.6～8.5 log2，抗體合格率為100%；首免后21 d，免疫鵝群H7亞型HI抗體效價平均值為5.2 log2，抗體合格率為100%，50日齡加強免疫后14～ d至70 d（出欄），HI效價均值為7.7～9.3 log2，抗體合格率為100%（圖3）。

圖3 鵝免疫抗體HI效價變化

2.3 病原檢測情況

采集的所有咽肛拭子樣品中，均未檢出H5、H7亞型流感病毒核酸陽性。

2.4 免疫禽群臨床情況

免疫后所有禽群采食量均正常，精神狀況良好，注射部位無異常，沒有出現(xiàn)發(fā)病死亡情況。

3 分析與討論

“H5+H7”二價滅活疫苗的全面免疫是當(dāng)前防控H7N9流感的主要措施和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2017年3月以來，湖南、陜西、天津、內(nèi)蒙古等地相繼發(fā)生了家禽H7N9流感疫情。為有效控制疫情發(fā)生，農(nóng)業(yè)部決定開展H7N9流感全面免疫。本研究表明，“H5+H7”二價滅活疫苗能夠?qū)Ξ?dāng)前流行毒株產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，具有較強的抗原針對性，能抵御病毒攻擊，具有較好的免疫保護效果，同時無免疫副反應(yīng)，疫苗安全有效。

母源抗體的作用具有特異性和選擇性，可以保護雛雞免受特定病原體的攻擊。但過高的母源抗體對雛雞初次免疫反應(yīng)的影響也很大。本試驗發(fā)現(xiàn)，9日齡（首免日齡）肉雞的H5母源抗體效價較高，其幾何均值為7.3 log2，免疫后H5抗體效價均值急劇下降，其原因可能是母源抗體中和了疫苗中的抗原，因而可能造成H5N1保護的真空期。為盡量減少或避免母源抗體影響，建議定期檢測雛雞母源抗體，根據(jù)雛雞體內(nèi)母源抗體水平確定首免時間，優(yōu)化免疫程序。

本試驗發(fā)現(xiàn)，雞群在首免后21d均達到了較高的抗體效價（H5N1 Re-8株、H7N9 Re-1株抗體效價平均值均大于4 log2），到達了農(nóng)業(yè)部要求的標(biāo)準(zhǔn)。二次免疫后抗體平均值均明顯高于一次免疫，說明加強免疫效果明顯。鵝群首免后21 d 的H7抗體效價平均值大于4 log2，達到了農(nóng)業(yè)部的標(biāo)準(zhǔn)，但H5抗體效價平均值小于4 log2，未達到農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)。二次免疫后的H5和H7抗體平均值均明顯高于一次免疫，且均有較高的抗體效價（抗體效價平均值大于4 log2），說明加強免疫效果明顯。這與金大春等[5]、張濟培等[6]研究的“禽流感疫苗2次免疫的免疫效果較好”的結(jié)論一致。

群體免疫抗體合格率是衡量免疫質(zhì)量、預(yù)警重大疫病的指標(biāo)之一。研究表明，雞、鵝首免后21 d，群體H5亞型免疫抗體合格率低于70%的農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)，群體免疫不合格，達不到免疫保護要求，應(yīng)加強免疫。這也與楊澤林[7]的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

本研究以田間試驗方式，對常規(guī)養(yǎng)殖的肉雞（江村黃雞）、櫻桃谷白鴨、黑棕鵝各120只，按照預(yù)定的免疫程序進行“H5+H7”二價滅活疫苗免疫，定期采集血清測定抗體效價，評估該疫苗的免疫效果。試驗結(jié)果顯示：首免后21 d，雞群和鵝群的H7亞型抗體合格率均大于70%，H5抗體合格率均低于70%，但二免后的H5和H7抗體合格率均大于70%；鴨群首免后21d的H5和H7抗體合格率均大于70%。本試驗結(jié)果表明，“H5+H7”二價滅活疫苗的安全性和免疫效果較好，但對于生長周期超過70 d的家禽，一次免疫，不能對這兩種病毒同時提供保護，應(yīng)免疫兩次。