邱 燕，溫貴蘭，張升波

（1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2. 安順市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，貴州安順 561000）

沙門氏菌（Salmonella enteriditis）屬革蘭氏染色陰性的需氧及兼性厭氧菌，入侵機體后菌體裂解而產(chǎn)生內(nèi)毒素。人或畜禽食用被沙門氏菌污染的食物或飲水后，致病菌在腸道內(nèi)大量繁殖并進入血液循環(huán)造成菌血癥；進入腸道和血液的致病菌在和機體的相互作用下被裂解而釋放大量的內(nèi)毒素，造成機體發(fā)生中毒癥狀[1-2]。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）O157:H7 同沙門氏菌一樣屬腸桿菌科、革蘭氏陰性染色、兼性厭氧的一類食源性致病菌。該致病菌可粘附腸道粘膜，從而侵害腸道微絨毛。其產(chǎn)生的VERO毒素（VT），也稱類志賀氏毒素（SLT），能夠阻礙蛋白質(zhì)合成，致使患病機體出現(xiàn)突然的劇烈腹痛、腹瀉或出血性腹瀉，直至死亡[3]。單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種沒有芽孢的兼性厭氧革蘭氏染色陽性菌，簡稱LM。LM是一種細胞內(nèi)寄生菌，其對機體的致病性除了與入侵機體的致病菌數(shù)量有關(guān)外，還取決于機體的免疫力。孕婦、幼兒和年邁體弱者因免疫力低下易感染，產(chǎn)生惡心、嘔吐、腹瀉等中毒癥狀，嚴重者發(fā)生敗血癥和腦膜炎，孕婦會發(fā)生流產(chǎn)；健康人群感染后可出現(xiàn)輕微的感冒癥狀[4-5]。

近年來國際食品安全事故多發(fā)，食用被食源性致病菌污染的食物是其中的主要原因。沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單增李特菌是3種重要的食源性致病菌。據(jù)報道，日本、美國等發(fā)達國家的食物中毒事件中，40%～80%是由沙門氏菌引起的[6]；歐洲每年有超過16萬人感染沙門氏菌[7]。在美國，每年有超過7萬例大腸桿菌O157:H7感染患者。我國早在1988年曾報道有大腸桿菌O157:H7引起的腸道感染[8]。歐美國家曾多次發(fā)生單增李斯特菌引起的食物中毒，死亡率達30%以上[9]。

豬肉在我國居民飲食生活中占據(jù)著不可或缺的地位。受屠宰加工方式及運輸條件等因素影響，豬肉從屠宰場到餐桌的過程中，會不同程度地受到微生物污染。這些微生物中可能存在沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌等致病菌。為了解本地屠宰場出場豬肉中3種食源性致病菌污染情況，進行了采樣調(diào)查，為保證出場豬肉的衛(wèi)生安全提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

2016年3月6日至12日，選擇10個生豬屠宰場（點），每個場（點）采集同一批次宰殺的生豬肉樣5份，共50份。每份采集胴體背部、腿部或臀部肌肉約250 g，混勻，裝在清潔、無污染、不滲漏的器具內(nèi)，填寫抽樣單，冷藏運輸?shù)綄嶒炇覀錂z[10]。采樣前準備滅菌器具，按照程序到屠宰場點采樣。

1.2 檢測試劑

沙門氏菌測試片、大腸桿菌O157:H7測試片、李斯特菌測試板：廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司生產(chǎn)；緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基（SC）、四硫磺酸鈉煌綠培養(yǎng)基（TTB）、EC肉湯、山梨醇麥康凱平板（SAMAC）、改良CHRO Magar O157顯色平板、PALCAM 瓊脂、科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基、革蘭氏染液、生化鑒定管等：杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

1.3.1 試紙片（檢測板）初篩 取25 g豬肉樣品配成1:10的樣品稀釋液；取出檢測試紙片（檢測板），揭開上面的保護膜，吸取樣品稀釋液1 mL，均勻滴加到試紙片（檢測板）上，蓋上保護膜靜置，待培養(yǎng)基凝固后，于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～24 h。用同樣的方法滴加1 mL滅菌磷酸緩沖液于試紙片上做陰性對照，對照說明書查看試驗結(jié)果。1.3.2 細菌分離鑒定 對快速檢測初篩陽性的樣本，參照國標法分別做3種細菌的分離培養(yǎng)與鑒定試驗。根據(jù)試劑說明，提前準備好增菌液或培養(yǎng)基。檢測步驟如下（以沙門氏菌檢測為例）：（1）增菌。樣品經(jīng)處理后，用BPW 10倍稀釋；調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱溫度，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～18 h；取1 mL培養(yǎng)液，用TTB或SC 10倍稀釋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～24 h。（2）分離培養(yǎng)。用滅菌環(huán)取一環(huán)菌液于BS（或XLD）上劃線，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)40～48 h（如選擇XLD培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，需培養(yǎng)18～24 h）。（3）生化鑒定。根據(jù)不同培養(yǎng)基上的沙門氏菌生長特征，挑取特征菌落于生化鑒定管恒溫培養(yǎng)，做生化鑒定試驗，對照沙門氏菌生化反應(yīng)特征，判定結(jié)果[12-14]。

2 結(jié)果

2.1 分離菌在選擇性培養(yǎng)基上的生長特征

分離菌在XLD平板上呈現(xiàn)黑色、帶有金屬光澤的圓形菌落或呈現(xiàn)灰白色、圓形菌落，在BS平板上呈現(xiàn)黑色或部分有黑色水解圈的圓形菌落，符合沙門氏菌在XLD、BS平板培養(yǎng)基上的形態(tài)特征（圖1、圖2）。分離菌株在PALCAM瓊脂平板上呈現(xiàn)小的、圓形的、灰色或無色菌落，部分有黑色水解圈，符合李斯特菌在PALCAM瓊脂平板上的形態(tài)特征（圖3）。

圖1 疑似沙門氏菌分離株在XLD 瓊脂平板上的菌落

圖2 疑似沙門氏菌分離株在BS瓊脂平板上的菌落

圖3 疑似李斯特菌分離株在PALCAM瓊脂平板上的菌落

2.2 分離菌革蘭氏染色鏡檢

經(jīng)革蘭氏染色的分離菌在10×100倍顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)分離菌符合沙門氏菌（圖4）、大腸桿菌O157:H7（圖5）、單增李斯特菌（圖6）的染色、形態(tài)、排列特征。

圖4 疑似沙門氏菌分離株革蘭氏染色鏡檢

2.3 分離菌生化鑒定

經(jīng)生化鑒定，18份疑似沙門氏菌樣品中，有7份與沙門氏菌生化特征相符，確定為沙門氏菌陽性。生化鑒定結(jié)果詳見表1。

根據(jù)大腸桿菌O157:H7生化反應(yīng)特征表進行結(jié)果鑒定，發(fā)現(xiàn)5份疑似大腸桿菌O157:H7樣本中，只有1株菌符合大腸桿菌O157:H7生化反應(yīng)特征（表2）。

圖5 疑似大腸桿菌O157:H7分離株革蘭氏染色鏡檢

圖6 疑似單增李斯特氏菌分離株革蘭氏染色鏡檢

參照李斯特菌生化反應(yīng)特征表進行鑒定，發(fā)現(xiàn)8份疑似李斯特菌陽性菌樣本中，有 5份符合單增李斯特菌的生化鑒定要求（表3）。

2.4 綜合判定

綜合上述結(jié)果，10個生豬定點屠宰場（點）的豬肉樣品中，50份樣本的沙門氏菌快速檢測陽

編號 三糖鐵瓊脂 賴氨酸脫羧酶 結(jié)果判定斜面 底層 產(chǎn)氣 硫化氫性率為40%。20份樣本的大腸桿菌O157:H7陽性率為25%，單增李斯特菌陽性率為40%。用國標法對快速檢測的陽性樣本進行復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌陽性率為14%，大腸桿菌O157:H7陽性率為5%，單增李斯特菌陽性率為25%（表4）。

表1 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶生化管內(nèi)的反應(yīng)及判定結(jié)果

表2 5株疑似大腸桿菌O157:H7生化反應(yīng)特征

表3 8株疑似李斯特菌生化反應(yīng)情況

4個屠宰點中，有3個檢出沙門氏菌陽性；6個屠宰場中，有1個檢出沙門氏菌陽性（表5）。由于有6個場（點）檢測樣品數(shù)量不足，因此大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌檢測只做了4個場（點）：2個場的10份樣品中，均未檢出兩種致病菌陽性；2個點的10份樣品中，檢出大腸桿菌O157:H7陽性1份，單增李斯特菌陽性5份（表6）。

表4 測試片初篩及國標法鑒定結(jié)果

表5 10個屠宰場（點）沙門氏菌檢測結(jié)果

表6 4個場（點）大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌檢測結(jié)果

3 分析與討論

國內(nèi)有關(guān)學(xué)者對食源性致病菌污染情況做了不少調(diào)查：洪偉彬等[1]從廣東省東莞市各鎮(zhèn)屠宰場采集的320份豬肝樣品中，分離到64株沙門氏菌，陽性檢出率為20%；景小金等[11]從貴州省七個地州農(nóng)貿(mào)市場采集82份鮮豬肉樣品進行檢測，檢出16株食源性致病菌。本次調(diào)查的沙門氏菌檢出率為14%，大腸桿菌O157:H7 檢出率為5%，單增李斯特菌檢出率為25%，且2個屠宰點存在同一樣本中2～3種菌均為陽性的情況。這些數(shù)據(jù)說明該地屠宰場點出場豬肉的食源性致病菌污染較為嚴重，尤其是小型屠宰點，其陽性檢出率普遍高于屠宰場。

國標法是國際認可的檢驗標準，也是檢驗的基準方法?？焖贆z測片含有選擇性培養(yǎng)基及特有顯色指示劑和高分子吸水凝膠。它是運用微生物測試片專有技術(shù)，做成的一次性快速檢驗產(chǎn)品，一步培養(yǎng)15～24 h就可確認是否帶有致病菌。對比兩種方法，國標法準確可靠，但檢驗過程費時復(fù)雜；測試片檢驗過程簡單、快速，但特異性差，假陽性率高。因此需要盡快建立一種快速特異的檢測方法。

我國頒布的《生豬屠宰檢疫規(guī)程》及《生豬肉品品質(zhì)檢驗規(guī)程》（GB/T17996-1999）沒有對食源性致病菌檢驗做出規(guī)定。但2013年12月發(fā)布、2014年7月1日起實施的《食品中致病菌限量》（GB29921-2013），對預(yù)包裝食品中的肉制品做出了限量規(guī)定，明確規(guī)定沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌3種食源性致病菌不得檢出[11]?，F(xiàn)實情況是，本地90%以上的鮮豬肉來源于當?shù)匦⌒屯涝讏觯c）。生豬在小型屠宰場（點）經(jīng)簡單清洗、宰殺、開膛、劈半等處理后，就被運到市場售賣，一旦發(fā)生公共衛(wèi)生安全事故，很難追蹤溯源。因此，需要加快推進屠宰企業(yè)轉(zhuǎn)型升級，淘汰落后不規(guī)范的屠宰場（點），調(diào)整屠宰企業(yè)產(chǎn)能結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)生豬屠宰肉品商品化、品牌化。同時，加強對屠宰企業(yè)的監(jiān)督檢查，督促其按照行業(yè)標準生產(chǎn)加工，促使生豬屠宰加工行業(yè)走向健康、持續(xù)的發(fā)展道路，以確保居民吃上放心肉。

4 結(jié)論

本研究表明，本地屠宰場（點）出場豬肉的沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌3種食源性致病菌污染情況較嚴重，特別是小型屠宰點。這應(yīng)引起監(jiān)管部門的重視，加快推進屠宰企業(yè)轉(zhuǎn)型升級，確保出場豬肉的食品衛(wèi)生安全。本研究發(fā)現(xiàn)，測試片的檢測陽性率高于國標法，但準確性偏低，說明測試片存在特異性差的問題。傳統(tǒng)國標法雖然準確性高，但所需周期長，不適合用于快速檢測。因此，需盡快開發(fā)一種快速特異的檢測方法，用于屠宰場（點）致病菌的快速檢測。