于姝媛 李浩楠 朱紫嘉 王蘋 杜波

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)噪聲、增齡、耳毒性藥物以及耳蝸缺血再灌注引起的聽(tīng)力損失，都與活性氧自由基氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[1]。紅景天苷（salidroside，SA）作為紅景天屬植物中廣泛存在的酚苷類化合物，可從植物的根、莖中提取，亦可通過(guò)生物合成、化學(xué)合成等途徑合成[2]，具有天然抗氧化作用。Zhang等[3]通過(guò)大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)紅景天苷對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧損傷的保護(hù)作用呈劑量依賴性，認(rèn)為與紅景天苷能夠提高神經(jīng)元HIF-1的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-кB蛋白的超表達(dá)有關(guān)。也有研究表明紅景天苷可激活NRF2信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)NRF2核轉(zhuǎn)位，通過(guò)增加下游抗氧化酶表達(dá)來(lái)降低氧化應(yīng)激水平，從而減輕氧自由基對(duì)心臟的損害[4]。但紅景天苷是否具有抵抗藥物耳毒性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用耳蝸基底膜離體培養(yǎng)技術(shù)，離體水平觀察SA藥物對(duì)毛細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，并探討可能的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

DMEM-F12培養(yǎng)基，胎牛血清為Invitrogen公司產(chǎn)品。丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司。cDNA第一鏈合成試劑和qPCR擴(kuò)增試劑盒為羅氏診斷產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳蝸基底膜分離培養(yǎng) 取出生后4天的大鼠（由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。取材前先準(zhǔn)備培養(yǎng)基，在直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中加入完全培養(yǎng)液(1：1 DMEM/F12+10% FBS+100 U青霉素)500 μl，室溫放置30 min；在無(wú)菌條件下將大鼠斷頭取出聽(tīng)泡，于顯微鏡下去除螺旋韌帶分離耳蝸基底膜。將基底膜平鋪在預(yù)先加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部；3 h后向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充1000 μl完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取出生4天的Wistar大鼠，分離耳蝸基底膜，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)分為4組①對(duì)照組：正常培養(yǎng)的耳蝸基底膜培養(yǎng)24 h；②模型組：0.2 mmol/L的慶大霉素（gentamin，GM）作用24 h；③保護(hù)組：先用400 μmol/L的SA預(yù)處理培養(yǎng)耳蝸基底膜3 h后加入等濃度的GM繼續(xù)培養(yǎng)24 h；④單純SA作用組：為400 μmol/L的SA作用24 h。

1.2.3 Phalloidin染色標(biāo)記毛細(xì)胞F-actin培養(yǎng)結(jié)束棄掉培養(yǎng)基，加入4%的多聚甲醛固定液固定30 min，用PBS清洗3遍后加入1%的Triton X-100處理20 min；加入TRITC標(biāo)記的Phalloidin溶液(1：200)稀釋，常溫染色20 min；甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，照相。統(tǒng)計(jì)在耳蝸基底膜中的毛細(xì)胞存活數(shù)目，每個(gè)條件分別選擇中、底回共5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)長(zhǎng)度為200 μM。然后取平均值。

1.2.4 MDA、SOD和GSH-PX活力的測(cè)定 利用硫代巴比妥酸法（TBA）法檢測(cè)MDA的活力，利用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，用二硫?qū)Χ趸郊姿岱y(cè)定GSH-PX的活力。將各組細(xì)胞制成10%勻漿后按照說(shuō)明書(shū)的離心速度和時(shí)間收集上清液。并按照個(gè)說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行試驗(yàn)操作。以紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度值。并按照說(shuō)明書(shū)公式進(jìn)行計(jì)算MDA，SOD，GSH-PX活力。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NRF-2，HO-1以及NQO1 mRNA的表達(dá)用Trizol裂解培養(yǎng)好的各組細(xì)胞，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA的濃度和純度。取RNA5 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。引物序列為NRF2-F：5-CATTAGTCAGTCGCTCTC-3，NRF2-R：5-ACCGTGCCTTCAGTGTGC-3，GAPDH-F：5-GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3，GAPDH-R：5-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3，HO-1-F：5-GAGAGCATGTCC CAGGATTT-3，HO-1-R：5-GGTTCTGTTGTTTCGCTCT-3，NQO1-F；5-GCGTCTGGAGACTGTCTGGG-3，NQO1-R 5-CGGCTGGAATGGACTTGC-3。根據(jù)羅氏PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，cDNA模板為2 μl，上下游引物分別加1 μl（10 um），F(xiàn)astStart Essential DNA Green Master10 μl，超純水6 μl，混勻離心后放入羅氏Light Cycler PCR儀器中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃，10 min變性；然后95℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，15 s延伸收集測(cè)熒光，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min，檢測(cè)PCR產(chǎn)物溶解曲線。以GAPDH作為內(nèi)參照，依據(jù)公式Fold change=2-△△Ct計(jì)算NRF2，HO-1，NQO1 mRNA的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳蝸毛細(xì)胞染色觀察

TRITC標(biāo)記的Phalloidin染色毛細(xì)胞，共聚焦顯微鏡下對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞呈紅色熒光，3排外毛細(xì)胞和l排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，纖毛結(jié)構(gòu)清晰。GM作用24 h，外毛細(xì)胞排列紊亂，纖毛變形，出現(xiàn)毛細(xì)胞缺失。底回最為嚴(yán)重，頂回未見(jiàn)明顯缺失。計(jì)數(shù)中底回外毛細(xì)胞缺失率為(38.6±8.92)%，內(nèi)毛細(xì)胞缺失率為(41.5±6.42)%。SA預(yù)處理組內(nèi)外毛細(xì)胞缺失率分別為(9.76±3.34)%和(11.38±7.14)%，與GM作用組相比毛細(xì)胞存活明顯增加（P＜0.01），如圖1。

圖1 耳蝸基底膜激光共聚焦掃描圖像 A:空白對(duì)照組，為正常耳蝸基底膜培養(yǎng)24 h；B：模型組，0.2 mmol/L的GM作用24 h；C：SA作用組，400 μmol/L的SA作用24 h；D：保護(hù)組，用400 μmol/L的SA預(yù)處理培養(yǎng)耳蝸基底膜3 h后加GM作用24 h（X800）

2.2 MDA、SOD和GSH-PX活力的測(cè)定

分別在GM作用耳蝸后6、12和24 h時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)MDA、SOD和GSH，結(jié)果顯示，MDA含量在GM作用后6 h升高，12 h達(dá)到峰值，24 h略降低，但仍高于對(duì)照組。SOD活性和GSH含量在GM作用后開(kāi)始下降，呈時(shí)間依賴性。SA預(yù)處理可以明顯增加SOD活性和GSH含量，降低MDA含量。與GM作用組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異如圖2所示（P=0.0056，P＜0.01）。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NRF-2，HO-1以及NQO1 mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，結(jié)果如圖3所示，GM組雖然比對(duì)照組偏高但是并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SA預(yù)處理明顯增加耳蝸基底膜組織NRF2及其下游ARE元件及包含的HO-1和NQO1等抗氧化酶的表達(dá)，（P=0.0048，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

3 討論

藥物性耳聾是兒童后天性耳聾的主要原因，慶大霉素可在內(nèi)耳積蓄并影響內(nèi)耳蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生與清除失衡，引起內(nèi)耳氧化還原反應(yīng)狀態(tài)改變，導(dǎo)致耳蝸和前庭器官的細(xì)胞損害[5]。表現(xiàn)癥狀為：耳鳴、眩暈和聽(tīng)力下降等[6]。關(guān)于藥物性損傷的機(jī)制目前尚不清楚，有研究認(rèn)為這種慢性用藥過(guò)程中產(chǎn)生的耳毒性可能與自由基氧化損傷有關(guān)[7，8]。氨基糖苷類抗生素耳毒性的自由基學(xué)說(shuō)得到廣泛認(rèn)同。它認(rèn)為氨基糖苷類抗生素會(huì)導(dǎo)致內(nèi)耳氧自由基增多，氧自由基主要通過(guò)一系列的過(guò)氧化反應(yīng)造成組織細(xì)胞的損傷，往往損害細(xì)胞膜磷脂分子中不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，最終使生物膜受到嚴(yán)重?fù)p傷[8]。這被認(rèn)為是導(dǎo)致慶大霉素耳毒性的主要原因。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。SOD、GSH-PX是機(jī)體主要抗氧化酶，能夠有效清除自由基的產(chǎn)生。本研究中，筆者檢測(cè)了慶大霉素對(duì)耳蝸基底膜組織中SOD和GSH-PX的表達(dá)和活力的影響，首先我們將耳蝸基底膜經(jīng)慶大損傷后發(fā)現(xiàn)MDA活性有所增強(qiáng)，而SOD活性和GSH活性開(kāi)始下降，且呈時(shí)間依賴性。表明慶大霉素?fù)p傷后發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究使用慶大霉素作用于離體培養(yǎng)的耳蝸基底膜，可見(jiàn)毛細(xì)胞重度損傷和數(shù)目的減少。使用紅景天苷預(yù)處理后加慶大霉素組耳蝸基底膜，觀察到毛細(xì)胞雖較于正常培養(yǎng)組有差異，但是毛細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于單純慶大霉素處理組，且存活細(xì)胞數(shù)目多于慶大霉素作用組。耳蝸基底膜用紅景天苷保護(hù)組測(cè)定SOD活性和GSH活性均明顯升高。可見(jiàn)，紅景天苷預(yù)處理對(duì)慶大霉素的耳毒性有一定的保護(hù)作用。研究了紅景天苷對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及其相關(guān)的作用機(jī)制。

圖2 各組耳蝸基底膜分別培養(yǎng)6、12、24 h后，對(duì)MDA的含量（A）、SOD活性（B）以及GSH-PX活性（C）的測(cè)定

圖3 耳蝸基底膜在GM、SA、GM+SA分別作用24 h后NRF2、NQO1、HO-1的表達(dá)量

氧化還原狀態(tài)的改變可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達(dá)，其中氧化還原因子NRF2在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)及氧化損傷的自身防護(hù)機(jī)制中起重要作用。NRF2是一種內(nèi)源性機(jī)體抵抗氧化損傷或化學(xué)等刺激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。NRF2-ARE則是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵傳導(dǎo)通路，當(dāng)其在體內(nèi)被有毒有害物質(zhì)激活后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核能與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合形成NRF2-ARE信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)HO-1、NQO1等大量基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抵抗各種刺激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷[9]而作為體內(nèi)最重要的抗氧化通路的激活可誘導(dǎo)多重細(xì)胞保護(hù)作用的基因表達(dá)在對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷方面具有很大的潛力。以NRF2-ARE通路介導(dǎo)的解毒、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡、抗炎通路的研究[10]為預(yù)防和治療氨基糖苷類耳毒性藥物致聾提供了一條新的思路。

紅景天苷是從中藥紅景天的根莖中提取的主要活性成分，有研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷對(duì)氧糖剝奪的SHSY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[11]。且可以迅速通過(guò)血腦屏障，對(duì)腦缺血和阿爾茲海默病有治療作用。紅景天苷還能夠抑制百草枯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的紅細(xì)胞毒性，恢復(fù)了乳酸脫氫酶、SOD、GSH-PX的表達(dá)和活力，提示紅景天苷可能是通過(guò)氧化應(yīng)激酶發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，發(fā)現(xiàn)SA預(yù)處理明顯增加耳蝸組織NRF2的表達(dá)。NRF2反應(yīng)性表達(dá)增加，引起下游ARE元件及包含的HO-1和NQO1等抗氧化酶的表達(dá)水平增高，從而發(fā)揮抗氧化作用。因此推測(cè)NRF2-ARE信號(hào)通路的激活參與了SA對(duì)氨基糖苷類藥物耳毒性的抑制作用。