魏曉勇，葉子明，周瑜，秦超

(1武漢大學人民醫(yī)院，武漢 430060；2廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)

顱內(nèi)動脈瘤(IA)破裂所導致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是一種極為兇險的腦血管疾病，是腦卒中主要亞型之一[1]。研究[2]表明，人群中有2%～5%患有無癥狀性IA，其中約1/4的IA患者會發(fā)生SAH。約50%動脈瘤相關蛛網(wǎng)膜下腔出血(aSAH)患者死亡，另有25%遺留嚴重神經(jīng)功能障礙[3]。目前認為種族、性別、遺傳及一些獲得性因素是IA形成和發(fā)展的危險因素。Alg等[4]發(fā)現(xiàn)，rs6841581是與IA相關性最穩(wěn)定的單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)之一。rs6841581位于常染色體4q31.23，在血管內(nèi)皮素受體A(EDNRA)基因轉錄子(NM001957.3)5′端調節(jié)功能區(qū)域內(nèi)。由于疾病易感基因在不同地域和種群間可能具有遺傳差異，故仍需要對在不同種群中進行相關研究。目前，尚未見有EDNRA基因及其相關SNP位點與廣西壯族IA相關性研究報道。本研究采用PCR-RFLP方法檢測87例廣西壯族囊狀IA患者和111例健康查體對照者的EDNRA基因rs6841581位點基因型和等位基因頻率分布，并對其進行比較。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年11月～2015年10月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院收治的囊狀IA患者87例(觀察組)，男31例，女56例；年齡(58.76±12.28)歲。均經(jīng)全腦血管數(shù)字減影造影(DSA)檢查確診。單發(fā)IA患者70例，多發(fā)IA患者(IA數(shù)量≥2個)17例；共計107個囊狀IA，其中位于頸內(nèi)動脈48個、后交通動脈25個、大腦中動脈13個、大腦前動脈5個、前交通動脈12個、基底動脈4個。另選111例健康體檢者作對照(對照組)，男45例，女66例；年齡(61.58±8.46)歲。均同期MRA排除IA。所有入選對象均來自廣西壯族，同時排除顱內(nèi)梭形動脈瘤、夾層動脈瘤、腦動靜脈畸形。此研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有調查及抽血均獲患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 EDNRA基因rs6841581位點多態(tài)性檢測 ①DNA提取：抽取所有研究對象外周靜脈血5 mL，使用磁珠法手工核酸提取試劑盒(Xiamen Zeesan Biotech Co.Ltd)提取外周血有核細胞DNA。②PCR擴增：1.引物設計：根據(jù)NCBI提供的DNA序列，由上海生物工程公司設計合成PCR引物。PCR特異性擴增產(chǎn)物長度為408 bp。2.PCR反應體系組成：Template 1 μL(第一輪為基因組DNA，第二輪為首輪PCR產(chǎn)物)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，ddH2O 8 μL混勻，3 000 r/min瞬時離心后PCR儀擴增。3.巢式PCR反應條件：預變性94 ℃、5 min，隨后進行第一輪循環(huán)20個周期，第二輪循環(huán)35個周期的變性94 ℃、30 s，復性60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，再延伸72 ℃、10 min。4.PCR產(chǎn)物電泳檢測：使用1%瓊脂糖凝膠(Agarose LE)置于0.5×TBE電泳液在100 V恒壓下水平電泳30 min，檢測是否有特異性的擴增產(chǎn)物。③RFLP分析：取PCR產(chǎn)物0.5 μL，10×Buffer R 1 μL，Eco72Ⅰ內(nèi)切酶(10 U/μL)0.5 μL，ddH2O 8 μL，混勻，3 000 r/min瞬時離心，37 ℃、15 min，80 ℃、10 min酶切。取5 μL酶切產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，置于0.5×TBE電泳液并在120 V恒壓下水平電泳30 min后取出，放置在紫外光凝膠成像系統(tǒng)下觀察帶型。④DNA測序檢驗：從受試對象中隨機抽取AA、AG、GG三種基因型各15例PCR產(chǎn)物樣本，使用Sanger雙脫氧鏈終止法測序檢驗(3730XL測序儀)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用Pearson′sχ2檢驗及Fisher確切概率法檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR-RFLP反應產(chǎn)物電泳及基因型判定 PCR產(chǎn)物在紫外光凝膠成像系統(tǒng)下顯示為408 bp的單一條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)Eco72Ⅰ限制性內(nèi)切酶消化后，電泳檢測結果為rs6841581純合子型(G/G)顯示為252、156 bp兩根條帶。純合子型(A/A)顯示為408 bp一根條帶。雜合子型(A/G)顯示為408、252、156 bp三根條帶。隨機選取三型PCR產(chǎn)物各10份行Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序，結果與PCR-RFLP基因型判定一致。雜合子(A/G)基因型在該SNP位點顯示為A/G雙峰。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率分布 結果見表1。

表1 兩組基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組不同性別入選對象基因型和等位基因頻率分布 結果見表2。

表2 兩組不同性別入選對象基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4 觀察組IA單發(fā)、多發(fā)者基因型和等位基因頻率分布 結果見表3。由表3可知，單發(fā)IA和多發(fā)IA EDNRA基因rs6841581位點的基因型、等位基因頻率分布比較無顯著性差異。

表3 觀察組IA單發(fā)、多發(fā)者基因型和等位基因頻率分布(例)

3 討論

Vernooij等[5]認為，IA具有明顯的家族聚集性，超過20%IA患者具有家族史。Brown等[6]使用MRA篩查報告家族性IA患者一、二級親屬中IA患病風險為8.7%～13.0%，遠高于普通人群患病率。許多遺傳性結締組織病，包括常染色體顯性遺傳多囊腎疾病、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病、馬凡綜合征等也與IA形成有關[7]。根據(jù)IA家族聚集性特點及其與遺傳性結締組織病的聯(lián)系，可推斷遺傳因素在IA發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組EDNRA基因rs6841581位點三種基因型(AA/AG/GG)頻率及等位基因(A/G)頻率分布與對照組比較均無統(tǒng)計學差異，而在隱性遺傳模式下純合子GG基因型在觀察組中的頻率顯著高于對照組，提示EDNRA基因rs6841581位點可能與廣西壯族人群IA相關，純合子GG基因型可能是易感基因型。

以往文獻報道，不同地區(qū)、種群間aSAH發(fā)病率存在顯著差異。研究[8]認為，中國北京漢族人群發(fā)病率較低(2.0/10萬)。文獻[9]報道，芬蘭和日本是aSAH高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率分別為19.7/10萬和22.7/10萬。荷蘭、芬蘭和日本人群GWAS研究均證實EDNRA基因rs6841581位點與IA相關，且等位基因G為易感基因[10]。EDNRA基因與中國漢族人群散發(fā)IA相關性研究也表明，rs6841581等位基G攜帶者患IA風險較等位基因A高，純合子GG攜帶者患病風險是純合子AA的2.85倍[11]。IA的組織學特點主要為動脈血管壁的局部完整性受損，包括血管內(nèi)皮功能異常、內(nèi)膜增生、細胞成分的消亡及細胞外基質的紊亂等[12]。血管內(nèi)皮素是血管壁損傷后組織重塑過程中的強烈收縮劑。EDNRA是一種主要存在于血管平滑肌細胞，包括腦血管、心臟、腎臟及神經(jīng)元等在內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體，具有調節(jié)內(nèi)皮素主要的同工型-EDN1的血管收縮及有絲分裂的作用。EDNRA通過加快細胞周期進程和增殖來調節(jié)內(nèi)皮素1的有絲分裂效應。血管內(nèi)皮素信號在血管壁受損的地方被迅速激活可能有利于促進內(nèi)皮細胞修復損傷?；蚬δ苎芯勘砻鳎珽DNRA基因rs6841581位點的等位基因G可使EDNRA基因轉錄下調[13]。EDNRA轉錄下調可抑制EDN信號，干擾血管損傷的修復過程，限制血管祖細胞的活動而導致修復缺陷，進而可能促使IA形成和發(fā)展[10]。

本研究顯示，觀察組女性基因型、等位基因頻率分布和對照組比較無顯著差異。觀察組男性等位基因G頻率顯著高于男性對照組，提示SNPrs6841581等位基因G與廣西壯族人群男性IA患者相關。Nguyen等[14]流行病學研究發(fā)現(xiàn)，女性IA患病率高于男性，認為女性是IA的主要危險因素之一。女性患者動脈瘤擴大的風險是男性的1.26倍[15]。在不同年齡段中，女性aSAH患者發(fā)病率均高于男性，女性占IA相關SAH患者的比重也隨年齡增高而增大，女性易感IA的原因可能與內(nèi)分泌等因素有關，性激素受體在血管內(nèi)廣泛存在，除直接作用外還可能通過對脂肪代謝和凝血功能的影響產(chǎn)生作用。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降， 可使組織內(nèi)膠原蛋白含量降低， 從而導致血管壁強度降低，在血流作用下促使局部血管壁擴張而形成IA。由于女性額外具有的IA風險，使得 SNPrs6841581等位基因G作用對女性IA形成和發(fā)展的影響比重降低。這也可能是導致本研究中女性IA患者多于男性，而女性與SNPrs6841581相關關系卻呈陰性結果的原因。

本研究觀察組中多發(fā)IA患者17例，占IA患者總人數(shù) 19.5%，低于文獻[16]報道的27.9%。多發(fā)IA常分布在兩側腦動脈，特別是在兩側頸內(nèi)動脈及大腦中動脈上。多發(fā)IA的年破裂率為 6.8%，而單發(fā)IA的年破裂率僅為1．9%。學者認為多發(fā)性顱內(nèi)動脈動脈瘤在青少年IA患者中更為常見，相對于單發(fā)IA，多發(fā)IA可能與家族性IA及先天血管發(fā)育不良性IA更為相關[17]。兩種不同IA亞型特征提示它們的形成和發(fā)展機制以及易感基因位點多態(tài)性可能存在差異。本研究對單發(fā)IA患者和多發(fā)IA患者兩個亞組的EDNRA基因rs6841581位點基因型及等位基因頻率分布進行了相互比較，未發(fā)現(xiàn)該位點基因型和等位基因頻率在兩個IA患者亞組間有顯著性差異。造成這種結果的原因，可能由于IA是一種復雜基因遺傳病，EDNRA基因rs6841581位點基因型及等位基因頻率分布對廣西壯族IA人群的單、多發(fā)IA分型影響較小，也可能是由于總體樣本量偏少且分組后兩個IA亞組的人數(shù)較為懸殊，造成了統(tǒng)計學偏差。EDNRA基因rs6841581位點多態(tài)性與單發(fā)IA和多發(fā)IA亞組分型的關系還需進一步研究。

總之，廣西壯族人群IA患者存在EDNRA基因rs6841581位點多態(tài)性，GG基因型可能是IA的易感基因型。