劉 婷，張承英，蘇靜克，韓 寧，朱 彪

動脈硬化是一類以血管管壁增厚變硬、彈性減弱和管腔縮小為特征的疾病，它嚴(yán)重威脅著人類的健康。該病變從血管內(nèi)膜起始，內(nèi)皮細(xì)胞是抵御病變發(fā)生的第一道防線，而內(nèi)皮依賴性血管舒張功能紊亂則是本病發(fā)生的一個早期標(biāo)志[1, 2]。臨床發(fā)現(xiàn)，年齡是該病發(fā)生、發(fā)展的一個獨立危險因素，近90%的動脈硬化和冠狀動脈硬化性心臟病發(fā)生在55歲以上的老年人[3]。 GDF 11是一種能抵抗衰老的細(xì)胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員[4]。最近有研究表明，通過腹腔注射重組GDF 11，能夠促進(jìn)老齡小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而增加腦血管容積、增大血流量，從而使腦血管“返老還童”[5]。動脈硬化亦屬于衰老相關(guān)性疾病，本研究探討GDF 11對老齡小鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的影響，以期為臨床上治療動脈硬化提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選擇18個月齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠20只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。重組人GDF 11(Pepro Tech，美國)；去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)[Sigma，美國]；脂聯(lián)素(adiponectin)ELISA試劑盒(R&D，美國)；Krebs液自行配制(2.0 L三蒸水中加入氯化鈉13.5 g，氯化鉀685.4 mg，磷酸鎂278.4 mg，磷酸二氫鈉278.4 mg，碳酸氫鈉3.7 g，氯化鈣555.0 mg和葡萄糖4.0 g)；一抗[兔抗人單克隆Smad2/3，磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)抗體]、二抗[山羊抗兔單克隆抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記)](CST，美國)；BCA測定試劑盒(南京建成，中國)；PVDF膜(Millipore，美國)。

BL-420S型生物信號采集系統(tǒng)、JH-2型張力換能器與HV-4恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟，中國)；7600-020型全自動生化分析儀(日本日立公司)；340型酶標(biāo)儀(BDSL，英國)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一，中國)。

1.2 實驗分組 小鼠于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(25±1)℃，相對濕度(65±5)%，光照12 h/d。所有小鼠均單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表均分為Vehi組(n=10)和GDF11組(n=10)。GDF11組按0.3 mg/(kg·d)的劑量連續(xù)4周腹腔注射GDF11，Vehi組則注射等量生理鹽水。

1.3 小鼠體重和血液學(xué)指標(biāo)檢測 每3 d測量一次所有小鼠的體重。實驗結(jié)束前12 h開始，所有小鼠禁食但不禁水。實驗結(jié)束時，按60 mg/kg的劑量腹腔注射10 g/L戊巴比妥進(jìn)行麻醉，開腹后用棉簽將腹腔臟器撥至左側(cè)，BD針于后腔靜脈采血后注入黃蓋促凝采血管，待血液凝固后收集血清置于液氮中凍存?zhèn)溆?。迅速開胸，去除肺組織，在體式顯微鏡下用顯微剪和顯微鑷剝離胸主動脈血管鞘及其周圍的結(jié)締組織。然后齊根端剪斷肋間動脈，剪下胸主動脈并將其均分為兩段，一段凍存于液氮中；另一段浸泡于Krebs液中備用(4 h內(nèi)檢測)。使用全自動生化分析儀檢測血清中三酰甘油(triglycerides，TG)和膽固醇(total cholesterol，TC)的含量。嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明，ELISA法檢測脂聯(lián)素的含量。

1.4 胸主動脈血管舒張功能測定 將每只小鼠的胸主動脈降段剪成2段，每段長約4 mm。將血管環(huán)置于含Krebs液的恒溫(37 ℃)灌流系統(tǒng)的浴槽中，并持續(xù)輸入95% O2+5% CO2的混合氣體。使用兩根不銹鋼鋼絲平行于管壁穿過血管環(huán)，下端鋼絲通過掛鉤固定于槽底，上端鋼絲通過掛鉤連接于張力換能器，張力換能器與生物信號采集系統(tǒng)相連，可記錄血管環(huán)張力的變化。調(diào)整基礎(chǔ)張力值為0.5 g，平衡約1 h，期間每20 min換一次Krebs液。待張力平衡后，向浴槽內(nèi)加入10-6mol/L的NE收縮血管環(huán)，待血管環(huán)收縮達(dá)平臺期時記錄最大張力值。排凈含有NE的Krebs液，依次加入不同濃度(10-9～10-4mol/L；每次換液前均以Krebs液灌洗3次血管環(huán))的Ach或者SNP誘導(dǎo)血管環(huán)舒張，并記錄每只小鼠各濃度下血管環(huán)的張力值(取4個血管環(huán)的平均張力)。采用下面的公式計算血管舒張率：血管舒張率(%)=[(最大張力值-各濃度點張力值)/(最大張力值-基礎(chǔ)張力值)]×100%。

1.5 Western blot檢測 取出液氮中凍存的主動脈，制備組織勻漿并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各樣本取50 μg總蛋白，上樣于PAGE膠后電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，室溫下封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h，最后用化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影。

2 結(jié) 果

2.1 GDF 11對老齡鼠體重及脂代謝的影響 相較于Vehi組，GDF 11干預(yù)全程不引起老齡鼠體重的改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)，GDF 11干預(yù)顯著降低血清中TG的水平[(76.6±11.2)vs(64.5±10.4) mg/dl]，TC的濃度也呈降低的趨勢[(149±17)vs(124±20) mg/dl]。同時，GDF 11干預(yù)可顯著升高血清中脂聯(lián)素的濃度[(11.9±1.1)vs(14.2±1.7) μg/ml]。

2.2 GDF 11對老齡鼠血管舒張功能的影響 加入不同濃度Ach后，兩組老齡鼠的血管環(huán)均出現(xiàn)不同程度的內(nèi)皮依賴性舒張，在10-6、10-5、10-4(mol/L)濃度時，GDF 11顯著升高內(nèi)皮依賴性血管舒張率[(37.1±5.2)%vs(59.7±4.3)%、(48.2±4.0)%vs(78.4±5.6)%、(61.1±4.7)%vs(90.2±7.4)% ]；差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)，而各濃度SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。

圖1 GDF 11對老齡鼠體重的影響

圖2 GDF 11對老齡鼠血管舒張功能的影響

A.不同濃度Ach誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)，B.不同濃度SNP誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)。 *表示與Vehi組相比P<0.05

2.3 Samd2/3的磷酸化水平 與Vehi組相比，GDF 11組p-Smad2/Smad2 [(1.00±0.05)vs(1.78±0.10)]、p-Smad3/Smad3 [(1.00±0.09)vs(1.57±0.12)]水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 GDF 11對Samd2/3磷酸化水平的影響

3 討 論

本研究以重組GDF 11干預(yù)的老齡鼠為動物模型進(jìn)行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF 11可以增強老齡鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，但對非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能無影響，從而證明GDF 11對因增齡而受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動脈硬化發(fā)生、發(fā)展的早期病理改變，檢測內(nèi)皮依賴性血管舒張功能可以預(yù)測該病發(fā)生的風(fēng)險，早期診斷并評估預(yù)后[6]。通過加入Ach可以誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，Ach與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的M型膽堿能受體結(jié)合，刺激細(xì)胞合成、分泌內(nèi)皮依賴性血管舒張因子，這些舒張因子以旁分泌的形式作用于血管壁中膜平滑肌細(xì)胞使其松弛。而硝酸甘油和SNP等硝基化合物則可以不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞，直接釋放NO等舒血管物質(zhì)作用于血管平滑肌細(xì)胞使其舒張。在本研究中，兩組血管環(huán)的非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能無顯著性差異，說明血管平滑肌細(xì)胞的功能未因增齡而受損。所以Ach誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管舒張反應(yīng)差異是由于內(nèi)皮細(xì)胞功能不同造成的，即GDF 11通過改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能保護(hù)因增齡而受損的血管。以往有研究報道發(fā)現(xiàn)GDF 11可以改善高脂飲食誘導(dǎo)造成的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能紊亂[7]，這與本研究的結(jié)果相似。

動脈硬化病變從血管內(nèi)膜開始出現(xiàn)脂質(zhì)堆積，引起血管壁的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤，泡沫細(xì)胞形成，細(xì)胞外基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞增生。由此可見脂代謝異常是動脈硬化發(fā)生的病變基礎(chǔ)。本研究結(jié)果也表明，GDF 11能降低血清中TG和TC的濃度，并且能夠顯著升高血中脂聯(lián)素的濃度。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性的生物活性肽，已被證實具有抗動脈粥樣硬化和炎性反應(yīng)的作用。以往的研究結(jié)果顯示，血管周圍脂肪組織分泌的脂聯(lián)素以旁分泌的形式[8]，機體其他部位脂肪組織分泌的脂聯(lián)素以內(nèi)分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對其有直接、確切的保護(hù)作用[9, 10]。脂聯(lián)素與內(nèi)皮細(xì)胞上的脂聯(lián)素受體結(jié)合后通過激活A(yù)MPK-eNOS信號途徑增加NO的產(chǎn)量，而血循環(huán)中脂聯(lián)素的濃度在肥胖、2型糖尿病和老年個體中均下降[11]。GDF 11可能是通過延緩因增齡而降低的脂聯(lián)素濃度或者直接升高血循環(huán)中脂聯(lián)素的含量來間接保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的。以上結(jié)果提示，改善脂代謝可能是GDF 11間接發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用的機制之一。

TGF-β超家族廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化和胚胎發(fā)育[12]。GDF 11可結(jié)合于細(xì)胞表面的TGF-β Ⅱ型受體，將該受體被激活后，其激酶活性將TGF-β Ⅰ型受體磷酸化激活；TGF-β Ⅰ型受體又使Smad2和Smad3磷酸化；磷酸化的Smad2和Smad3可與Smad4形成三聚體，并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)[13]。梅穩(wěn)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GDF 11可以通過激活糖尿病小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中的Samd2/3信號通路，上調(diào)eNOS活性，進(jìn)而增加NO等舒血管因子的產(chǎn)量來保護(hù)血管。本研究的結(jié)果也表明，GDF 11干預(yù)可以顯著提高主動脈Samd2/3的磷酸化水平。這提示激活Samd2/3信號通路可能是GDF 11直接發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的信號機制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GDF 11能夠改善老齡鼠胸主動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。因此，升高體內(nèi)因增齡而下降的GDF11濃度可能是預(yù)防和治療衰老性動脈硬化的一個潛在靶點。