◎ 侯笑林，劉家岐，高 涵，楊延存

（青島工學(xué)院，山東 青島 266300）

黑蒜又名黑大蒜、發(fā)酵黑蒜、黑蒜頭，是將新鮮的生蒜帶皮放在高溫高濕的發(fā)酵箱里發(fā)酵60～90天，讓其自然發(fā)酵制成的食品[1]。黑蒜在保留生大蒜原有成分和功能的基礎(chǔ)上，使生大蒜的抗氧化、抗酸化功效提高了數(shù)十倍，又把生大蒜本身的蛋白質(zhì)大量轉(zhuǎn)化成為人體所必需的8種氨基酸，進(jìn)而被人體迅速吸收，對(duì)增強(qiáng)人體免疫力、恢復(fù)人體疲勞，保持人體健康起到巨大積極作用[2]。本文以黑蒜為原料，采用乙醇浸提法提取黑蒜中總酚，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其總酚的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，研究最佳提取工藝條件及顯著影響因素，以期提高黑蒜總酚的提取量，同時(shí)以體外抗氧化體系為模型，研究其抗氧化活性，為進(jìn)一步開展黑蒜活性物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑蒜，網(wǎng)上采購，新鮮、無公害、無糜爛。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A型BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?？德穬x器設(shè)備有限公司）、40目篩、80-2電動(dòng)離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（上海梅香儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）、JM-B5102分析天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）、多功能粉碎機(jī)（鉑歐五金廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑蒜總酚提取流程[3-4]

黑蒜→去皮→清洗→烘干→粉碎、過篩→稱取黑蒜粉末樣品→按一定料液比加乙醇溶液→恒溫提取→離心分離→上清液冷藏。

1.3.2 黑蒜總酚提取率的測(cè)定及計(jì)算方法[5]

以焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取20 mg，用水溶液溶解，定容到100 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液。分別準(zhǔn)確移取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支25 mL納氏比色管中，加入Folin-ciocalteu試劑1.0 mL，搖勻后加入15%碳酸鈉溶液2 mL，定容至10 mL，搖勻，放置2 h，于波長760 nm處測(cè)定吸光度，以焦性沒食子酸含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取一定體積粗多酚溶液于比色管中，按上述步驟測(cè)定其測(cè)定吸光度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)的濃度，計(jì)算總酚提取量。

W=C×V/m

式中：W為總酚提取量，單位為mg/g；C為Folinciocalteu法測(cè)定的提取液質(zhì)量濃度，單位為g；V為提取液體積，單位為mL；m為黑蒜粉末質(zhì)量，單位為g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蒜總酚提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按照料液比1∶25分別加入體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%和90%的乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

（2）料液比對(duì)黑蒜總酚提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，分別按料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳料液比。

（3）提取溫度對(duì)黑蒜總酚提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按料液比為1∶25加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，分別在提取溫度為30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下提取40 min，離心分離，以總酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取溫度。

（4）提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g黑蒜干粉放入錐形瓶中，按料液比為1∶25加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，在50 ℃提取溫度條件下分別提取20、40、60、80 min和100 min，離心分離，以總酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取時(shí)間。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間四因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)計(jì)三個(gè)水平，以總酚提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化黑蒜總酚提取工藝條件。

1.3.5 黑蒜總酚抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH清除作用的測(cè)定[6-7]。取不同質(zhì)量濃度樣品溶液4 mL于試管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水做空白。以相同濃度維生素C作對(duì)比。

式中，A1為4 mL樣液+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值；A2為4 mL樣液+2 mL 95%的乙醇對(duì)應(yīng)吸光度值；A3為4 mL蒸餾水+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值。

（2）超氧自由基（O2-）清除作用的測(cè)定[8-9]。采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定，取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液4.0 mL，于25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入不同質(zhì)量濃度1 mL樣液和1 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8%的HCl 1 mL終止反應(yīng)，325 nm處測(cè)定吸光度（A）。用蒸餾水做空白。以相同濃度維生素C作對(duì)比。

式中，Ai為4 mL Tris-HCl+1 mL樣液+2 mL鄰苯三酚對(duì)應(yīng)吸光度值；Aj為4 mL Tris-HCl+1 mL樣液+2 mL蒸餾水對(duì)應(yīng)吸光度值；Ac為4 mL Tris-HCl+1 mL蒸餾水+2 mL鄰苯三酚對(duì)應(yīng)吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蒜總酚提取量的影響

從圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～50%時(shí)，黑蒜中總酚的提取量逐漸升高，且在50%時(shí)達(dá)到最高，原因可能是多酚類物質(zhì)在乙醇水溶液中的溶解度逐漸增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%以上時(shí)，總酚提取量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，這可能是由于提取液中除多酚外的其他雜質(zhì)逐漸增多，同時(shí)提取溶劑中水分減少，造成測(cè)定體系中多酚含量降低，測(cè)定數(shù)據(jù)下降。因此確定最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑蒜總酚提取量的影響圖

2.2 料液比對(duì)黑蒜總酚提取量的影響

料液比是影響原料中總酚提取的因素之一。適當(dāng)?shù)牧弦罕燃纯墒乖现械亩喾游镔|(zhì)得到充分提取，還可減少溶劑的消耗及其回收成本。由圖2可以看出，隨著料液比的增加，總酚的提取量逐漸增加，在料液比為1∶10～1∶20時(shí)總酚提取量增加的幅度較為明顯；但是當(dāng)料液比大于1∶20時(shí)，總酚提取量增加的幅度不大，表明當(dāng)料液比增大到1∶20時(shí)原料中的多酚類物質(zhì)已被充分提取出來，總酚提取量達(dá)到峰值，因而繼續(xù)增大料液比，總酚提取量不會(huì)明顯提高，而且在實(shí)際生產(chǎn)中還造成溶劑浪費(fèi)。因此，確定最佳的料液比為1∶20。

圖2 料液比對(duì)黑蒜總酚提取量的影響圖

2.3 提取溫度對(duì)黑蒜總酚提取量的影響

由圖3可知，30～50 ℃時(shí)，總酚提取量隨溫度的升高而增大，在50 ℃是總酚提取量最高。這是由于隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，隨溫度上升產(chǎn)生的大量熱能破壞了黑蒜內(nèi)各物質(zhì)之間的氫健和疏水健，大量多酚類物質(zhì)的滲透、溶解、擴(kuò)散速度加快，從而促進(jìn)了原料中多酚類物質(zhì)的溶出，是總酚提取量得以提高。60～70 ℃時(shí)，總酚提取量反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性較差或者長時(shí)間受熱影響了多酚氧化酶的催化能力，自身發(fā)生氧化或水解反應(yīng)所致。因此，黑蒜中總酚提取的溫度不宜過高，以50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對(duì)黑蒜總酚提取量的影響圖

2.4 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取量的影響

從圖4可以看出，黑蒜中總酚的提取量隨提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，在60 min時(shí)達(dá)到峰值，60 min后隨著時(shí)間的延續(xù)，總酚提取量出現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，黑蒜中多酚物質(zhì)的溶解程度逐漸增強(qiáng)，而在60 min時(shí)達(dá)到峰值后，多酚的溶出已經(jīng)接近于飽和，再繼續(xù)增加提取時(shí)間的時(shí)候，析出的多酚由于受光、熱、多酚氧化酶等各種外界因素的影響，極易被氧化。因此，60 min后反而隨著時(shí)間的增加多酚提取量出現(xiàn)下降的情況。因此，確定最佳提取時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取量的影響圖

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

由表1可知，試驗(yàn)中4個(gè)因素的影響力大小順序?yàn)锳＞D＞B＞C，對(duì)應(yīng)影響黑蒜總酚提取效果因素的強(qiáng)弱順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度，且黑蒜總酚提取的最佳提取工藝為A2B2C3D2。由于計(jì)算出的最優(yōu)組合不包含在正交表中，因而按最優(yōu)組合配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出黑蒜總酚提取量為1.82 mg/g，因此確定A2B2C3D2為提取黑蒜總酚的最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 黑蒜總酚對(duì)DPPH清除率的影響

對(duì)DPPH清除率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖可見，黑蒜總酚具有較強(qiáng)的清除DPPH的能力，隨著黑蒜總酚溶液濃度的增大，清除能力顯著提高。在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，黑蒜總酚對(duì)DPPH清除率為56.8%，而在相同濃度下，維生素C對(duì)DPPH的清除率僅為40.1%，表明黑蒜總酚對(duì)DPPH清除率比維生素C高。

圖5 黑蒜總酚與維生素C對(duì)DPPH清除率的影響圖

2.7 黑蒜總酚對(duì)O2-清除率的影響

圖6 黑蒜總酚和維生素C對(duì)清除率的影響圖

3 結(jié)論

（1）乙醇浸提法提取黑蒜總酚的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶20、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min，在此條件下，黑蒜總酚的提取量可達(dá)1.82 mg/g。

（2）黑蒜總酚對(duì)DPPH和O2-均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，在一定濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而升高，且高于同濃度維生素C的清除率，說明黑蒜總酚的抗氧化性能較強(qiáng)。通過對(duì)所得總酚品質(zhì)特性的研究，為黑蒜資源的綜合利用和黑蒜中多酚類物質(zhì)開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。