◎ 鄭立國，鄒應(yīng)立，于艷萍

（1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130000；2.長春大成實業(yè)集團(tuán)有限公司，吉林 長春 130000）

蘇氨酸是人體必需氨基酸之一，有緩解人體疲勞、促進(jìn)生長發(fā)育的效果[1]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和工藝水平的提高，以淀粉等糖質(zhì)為主要原料，經(jīng)微生物深層發(fā)酵、提取、精制而成L-蘇氨酸的發(fā)酵技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[2]。該技術(shù)具有投資少、見效快，經(jīng)濟(jì)與社會效益顯著等諸多優(yōu)點[3]，然而生產(chǎn)過程中剩余的母液有化學(xué)含氧量高等特點，不可直接排放[4]，嚴(yán)重困擾著發(fā)酵行業(yè)[5]。國外采取膜分離技術(shù)分離營養(yǎng)物質(zhì)、無機(jī)鹽等方法處理母液，具有工藝復(fù)雜、設(shè)備及工藝要求較高、成本高的特點；國內(nèi)一般采用二次提取，母液污水處理后直排的方法[6]，但存在高濃度有機(jī)廢水的處理費用高、周期長、對環(huán)境影響較大等問題[7]。一部分企業(yè)采用母液制造化肥或再提取工藝處理母液[8]，存在環(huán)境污染嚴(yán)重、成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。

本試驗將蘇氨酸母液糖化后，用酵母菌發(fā)酵將還原性糖轉(zhuǎn)化為酒精、二氧化碳和水，這樣有利于降低母液黏度，方便對蘇氨酸母液中殘留的蘇氨酸二次提取和廢液處理[9]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

啤酒酵母菌，購自青島慧瑞生物科技有限公司；糖化后的蘇氨酸母液，由大成生化科技松原有限公司提供。

1.2 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司）、TDL-80-2B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、超凈工作臺單人雙面（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、722分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、分析天平(上海奕宇有限公司)、搖瓶機(jī)（金壇市良友儀器有限公司）。

1.3 發(fā)酵條件的確立

1.3.1 接種量對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

分別量取300 mL糖化后的蘇氨酸母液于5個三角燒瓶中，調(diào)pH值在4.0～4.5，分別加入0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的啤酒酵母干粉。先好氧培養(yǎng)，6 h之后再蓋上瓶蓋厭氧培養(yǎng)。

1.3.2 發(fā)酵溫度對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

分別量取300 mL，調(diào)pH值在4.0～4.5，加入1.3.1確定的啤酒酵母干粉量。先好氧培養(yǎng)，6 h之后再蓋上瓶蓋厭氧培養(yǎng)，分別為在30、31、32、33 ℃和34 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 發(fā)酵時間對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

分別量取300 mL，調(diào)pH值在4.0～4.5，加入1.3.1確定的啤酒酵母干粉量。先好氧培養(yǎng)，6 h之后再蓋上瓶蓋厭氧培養(yǎng)，在1.3.2確定的培養(yǎng)溫度下分別培養(yǎng)6、12、18、24 h 和 30 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 還原糖測定方法

（1）化學(xué)反應(yīng)：

CuSO4+KI=I2+CuI+2K2SO4

I2+2Na2S2O3=2NaI+Na2S4O6

（2）試劑。A液：硫酸銅；B液：酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉；C液：碘化鉀；D液：硫酸；E液：硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉；2%淀粉指示劑；濃鹽酸；0.2%甲基紅指示液；40%NaOH；0.1N K2Cr2O7標(biāo)液的配制：準(zhǔn)確稱取4.903 g經(jīng)140～150 ℃烘干至恒重的K2Cr2O7溶于200 mL水中，完全溶解后，移至1 L容量瓶中，以蒸餾水稀釋至刻度。

（3）葡萄糖的測定（RS值）。向已加入30 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中加入1.00 mL樣品，搖勻，準(zhǔn)確加入10 mL A液、10 mL B液后置于電爐上加熱至沸騰后計時2 min，取下錐形瓶冷卻至室溫，向其中加入10 mL C液與10 mL D液，立即用E液滴定，近終點時，加入一管淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至淡粉色即為滴定終點。同時做空白（空白時終點為淡紫色）。

計算公式。

D=F×(VA-VB)；F=VK÷VE；C=G÷10×0.95

式中，D為消耗標(biāo)液的系數(shù)；VA為A液體積（空白滴定量），單位mL；VB為B液體積（樣品滴定量），單位mL；F為E液因數(shù)；VK為K2Cr2O7標(biāo)液體積，單位mL；VE為消耗E液體積，單位mL；C為蘇氨酸母液中葡萄糖濃度，單位g/dl；G為由得出的D值對應(yīng)糖表的葡萄糖濃度，單位g/dl。

1.4.2 總糖的測定方法

用移液管準(zhǔn)確移取5.00 mL樣品，加入90～100 mL蒸餾水、5 mL濃鹽酸，置于500 mL錐形瓶中（移液管需用少量蒸餾水沖洗二次），加塞，塞上插有一玻璃彎管，用紗布包好，置于100 ℃的水浴鍋內(nèi)水解2 h后取出，冷卻后清洗瓶塞、錐形瓶，加入2 d甲基紅指示液，用氫氧化鈉調(diào)成黃色，定容至500 mL。

從中取出5.00 mL，測定方法同葡萄糖。

計算公式。

D=5×(VA-VB)×F；F=VK÷VE；C=G÷10×0.95

式中，D為消耗標(biāo)液的系數(shù)；VA為A液體積（空白滴定量），單位mL；VB為B液體積（樣品滴定量），單位mL；F為E液因數(shù)；VK為K2Cr2O7標(biāo)液體積，單位mL；VE為消耗E液體積，單位mL；C為蘇氨酸母液中葡萄糖濃度，單位g/dl；G為由得出的D值對應(yīng)糖表的葡萄糖濃度，單位g/dl。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

采用對比方法，設(shè)置相同培養(yǎng)條件，5個培養(yǎng)瓶中分別添加0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的酵母菌粉。溫度為32 ℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h檢測，記錄實驗數(shù)據(jù)。如圖1所示，隨著接種量的提高，還原糖、總糖含量會逐漸降低。然而當(dāng)達(dá)到1.5%及2%時，降低雖然比1%添加量大，卻無明顯差異。根據(jù)成本控制原理，確定1%為最佳添加量。

圖1 接種量對蘇氨酸母液糖濃度的影響圖

2.2 發(fā)酵溫度對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

啤酒酵母在適度溫度情況下，作用效果較好。溫度對酵母菌的影響直接決定了效果。在確定了最佳接菌量后，根據(jù)酵母菌培養(yǎng)特性，適度調(diào)整接菌溫度，分別在30、31、32、33 ℃和34 ℃溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。試驗中經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，對比5種溫度培養(yǎng)條件下還原糖、總糖變化情況。記錄實驗數(shù)據(jù)。如圖2所示，幾種培養(yǎng)條件下，還原糖明顯降低。在32 ℃培養(yǎng)條件下還原糖、總糖降低幅度最大，因此確定32 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

圖2 發(fā)酵溫度對蘇氨酸母液糖濃度的影響圖

2.3 發(fā)酵時間對糖化后蘇氨酸母液發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程中，發(fā)酵時間是根據(jù)菌種作用效果及產(chǎn)量與能耗對比值確定的。在菌種作用接近最佳效果時，應(yīng)立即結(jié)束培養(yǎng)，否則產(chǎn)量與能耗不成正比，而造成成本降低。

在確定最佳接菌量、最佳培養(yǎng)溫度后，實驗確定培養(yǎng)時間對還原糖、總糖的作用效果。分別在12、15、18、21 h和24 h進(jìn)行取樣檢測，并記錄檢測結(jié)果。如圖3所示，培養(yǎng)隨時間增長而逐漸效果明顯，在18 h后，作用效果便緩慢，確定18 h后繼續(xù)培養(yǎng)成本價值低，因此確定最佳培養(yǎng)時間為18 h。

圖3 發(fā)酵時間對蘇氨酸母液糖濃度的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過酵母菌處理后的糖化母液還原糖、與總糖明顯降低，更利于再濃縮提取?？偸章时任刺幚淼哪敢菏章矢?，同樣在膜過濾處理過程中收率提高約1.3%，此實驗方法具有一定可行性。在大生產(chǎn)中具有相當(dāng)優(yōu)勢，有一定利潤空間。

對啤酒酵母菌作用糖化母液的培養(yǎng)條件中的接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進(jìn)行了確定。在母液處理與綜合利用和檢測方面論述了應(yīng)用的可行性。酵母菌菌種在適當(dāng)條件下對還原糖進(jìn)行利用，轉(zhuǎn)化為酵母菌體蛋白。證明酵母菌對殘?zhí)堑睦脙r值。為發(fā)酵行業(yè)母液處理提供了全新的思路。