楊 科 丁 宏 羅祥波 普仕華 郭兆衛(wèi) 侯明省 馮德正 張書光*

（1.德宏州動物疫病預(yù)防控制中心，云南芒市 678400;2.梁河縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南梁河 679200;3.隴川縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南隴川 678700）

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化方向發(fā)展，豬群常發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍(lán)耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養(yǎng)豬業(yè)的四大病毒性疫病。近年來這四種病毒病溫和型不斷出現(xiàn)，通過臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無法做出準(zhǔn)確的診斷，常常需要借助實驗室檢測才能做出確診，而實驗室檢測需要組織處理、核酸提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測四大流程，四種病毒病檢測下來最快需要兩到三天甚至更久，使得養(yǎng)殖戶蒙受巨大損失，因此如何在不影響靈敏度和準(zhǔn)確度的前提下縮短檢測流程已迫在眉睫。我們獸醫(yī)實驗室經(jīng)過大量摸索，樣品處理、核酸提取流程均已優(yōu)化，可在半個小時內(nèi)提取到總核酸，在此基礎(chǔ)上建立起了一種單臺PCR、單次PCR擴(kuò)增、一次性檢測豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬病毒四種病原的方法。

1 材料與方法

1.1 陽性病料和引物設(shè)計、合成

陽性病料和豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬病毒檢測引物由云南省動物疫病預(yù)防控制中心提供。引物擴(kuò)增片段大小為350bp。

1.2 儀器設(shè)備、酶和試劑盒

核酸自動提取儀NP968-S（西安天?。?，震動球磨儀GT200（格瑞德曼），PCR儀（德國耶拿），Syngene凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（西安天?。?，PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3 總RNA的提取

分別應(yīng)用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒和從陽性病料（脾、肺、淋巴結(jié)）中提取總DNA/RNA，具體操作過程見說明書。

1.4 四種病毒快速診斷方法的建立

根據(jù)實驗室前期的大量摸索，豬瘟、藍(lán)耳、圓環(huán)、偽狂犬引物的最佳退火溫度分別為54℃、50℃、55℃、58℃，利用梯度PCR的touchdown功能（在引物退火溫度摸索過程中，每一列的溫度都不相同，將四種引物的最高和最低TM值作為區(qū)間），將四種檢測不同病毒核酸的體系放置于一臺PCR中進(jìn)行擴(kuò)增，一次擴(kuò)增相當(dāng)于利用四臺PCR同時擴(kuò)增，大大縮減PCR所需時間。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取效果圖

使用核酸自動提取儀提取法（磁珠法）提取陽性病料中的總核酸，電泳檢測發(fā)現(xiàn)提取出了高質(zhì)量的RNA，符合本實驗要求。

疫苗總RNA提取效果圖

2.2 四種病毒快速診斷方法的建立

3 討論

隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化方向發(fā)展，豬群常發(fā)生多病原混合感染、繼發(fā)感染，其中豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬藍(lán)耳病毒（PRRS）是較易混合感染的危害養(yǎng)豬業(yè)的四大病毒性疫病。近年來這四種病毒病溫和型不斷出現(xiàn)，通過臨床癥狀、病理解剖和藥物診斷往往無法做出準(zhǔn)確的診斷，常常需要借助實驗室檢測才能做出確診，而實驗室檢測需要組織處理、核酸提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測四大流程，四種病毒病檢測下來最快需要兩到三天甚至更久，使得養(yǎng)殖戶蒙受巨大損失。因此，我們建立了一種可快速準(zhǔn)確一步法檢測四種豬病的RT-PCR 技術(shù)。

目前RT-PCR檢測豬病的技術(shù)主要環(huán)節(jié)為樣品處理、核酸提取和穩(wěn)定的檢測引物三個方面。本實驗將四種豬病的檢測流程簡化為一次PCR擴(kuò)增，本來需要三天才能完成的檢測一天完成，大大縮減養(yǎng)殖戶等待檢測結(jié)果的時間，可以更好地為養(yǎng)殖戶提供診斷和治療建議。

試驗結(jié)果表明，一步法檢測四種豬病的RT-PCR 技術(shù)和單獨擴(kuò)增方法并無區(qū)別，只是利用PCR儀的touchdown功能，將本該四次PCR擴(kuò)增的步驟簡化為一步完成，大大縮減檢測時間，提高了監(jiān)測效率，可以廣泛推廣使用。