曾 艷，趙韶靜，張 任，李正東

0 引言

順鉑(Cisplatin，CDDP)作為抗腫瘤藥物，既可單獨使用，也可在中西醫(yī)聯(lián)合用藥方案中聯(lián)合應(yīng)用，在臨床上具有高效和廣譜特性[1-7]。但是該藥物具有一些嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如急性腎功能損傷(Acute kidney injury,AKI)或更嚴(yán)重的不可逆慢性腎功能衰竭，均在很大程度上限制順鉑的臨床應(yīng)用[8]。研究顯示，腎臟氧化性應(yīng)激頻率的增加與CDDP對腎臟損傷作用聯(lián)系緊密，作用機(jī)制為CDDP促使活性氧代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[9-10]。而導(dǎo)致該代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的主要原因為，腎臟組織遭到一定損傷致使氧自由基代謝失衡，伴隨腎組織脂質(zhì)氧化物濃度的增加[11]。因此，探索PEP-1-SOD聯(lián)合N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對急性腎損傷小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響對急性腎損傷的治療具有重要的提示作用。本研究采用PEP-1-SOD聯(lián)合NAC對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行治療，檢測模型小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的變化情況，以期為急性腎損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 EX224精密電子分析天平(美國OHAUS公司)；生化自動分析儀(瑞士羅氏診斷有限公司)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司)；HWS-28恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；ST40 ST40R臺式高速離心機(jī)(德國thermo有限公司)；T10高速組織勻漿機(jī)(德國IKA有限公司)。

1.1.2 所需試劑 順鉑、N-乙酰半胱氨酸(購自美國Sigma公司)；生理鹽水(購自山東齊魯制藥有限公司)；PEP-1-SOD蛋白(購自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽檢測試劑盒(購自美國Sigma公司)；谷胱甘肽檢測試劑盒(購自美國Biovision公司)；血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純試劑。

1.1.3 實驗動物及分組情況 清潔級(SPF)的10月齡雄性BALB/C小鼠購自中科院生物研究所實驗動物中心，共計60只，體重(30±2)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有小鼠隨機(jī)分為3組，分別為治療組、損傷組和對照組，每組20只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 急性腎損傷小鼠模型的建立 BALB/C小鼠在進(jìn)入實驗室動物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后進(jìn)食15 h，腹腔注射20 mg/kg的順鉑，注射前使用生理鹽水將順鉑稀釋至濃度為1 g/L，腹腔注射3 d誘導(dǎo)AKI模型。

1.2.2 給藥方法 在建立AKI模型1周后，治療組小鼠腹腔注射100 mg/(kg·d)的N-乙酰半胱氨酸及500 μg/(100 g·d)的PEP-1-SOD蛋白進(jìn)行治療，連續(xù)給藥7 d，損傷組和對照組小鼠則注射等體積的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.2.3 樣品獲得及處理 在誘導(dǎo)3 d后及治療后小鼠禁食禁水6 h，乙醚麻醉稱量小鼠體重，采取開胸心臟取血的方法取血1.0 ml，放置在4 ℃冰箱中靜置30 min，取出后加入至1 ml離心管中，以4 000 r/min離心10 min，使用移液器吸取血清留用。采血后打開小鼠腹腔，暴露膀胱并收集其中的尿液，暴露腹主動脈，從小鼠腹主動脈灌流冰預(yù)冷的PBS溶液，迅速取出雙腎并去除腎被膜，使用濾紙將腎表面的水分吸干后進(jìn)行稱重，腎臟指數(shù)=雙腎重(mg)/體重(g)。三組小鼠在建模后3 d取10只鼠的血和腎臟，其余10只在治療后取血和腎臟。

1.2.4 腎小管損傷評價 將三組小鼠腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋，然后使用切片機(jī)進(jìn)行病理切片，水化后進(jìn)行HE染色，由病理科兩位醫(yī)師在顯微鏡下觀察腎小管損傷情況，每張切片選擇10個視野。當(dāng)在顯微鏡下觀察到腎小管擴(kuò)張，刷狀緣脫落，空泡變性，節(jié)段性基底膜裸露，腎小管細(xì)胞壞死，則認(rèn)定為出現(xiàn)腎損傷。

腎損傷的嚴(yán)重程度評分按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：無損傷為0分；損傷≤10%為1分；損傷11%～25%為2分；損傷26%～45%為3分；損傷41%～57%為4分；損傷≥76%為5分。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測 使用全自動生化分析儀及配套試劑盒檢測血清中Cr和BUN含量。

1.2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取三組小鼠的腎組織，使用勻漿器進(jìn)行勻漿，采用相應(yīng)試劑盒檢測腎組織中SOD、MDA、GSH的水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腎臟損傷情況 結(jié)果顯示，治療組及損傷組小鼠治療前腎臟指數(shù)明顯低于對照組，治療組、損傷組及對照組小鼠治療后腎臟指數(shù)與治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腎臟指數(shù)比較

治療組及損傷組小鼠治療前腎臟損傷程度評分明顯高于對照組，治療組小鼠治療后腎臟損傷程度評分與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，損傷組及對照組小鼠治療后腎臟損傷程度評分與治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 各組小鼠腎臟損傷程度評分情況

2.2 小鼠生化指標(biāo)變化情況 治療組及損傷組小鼠治療前Cr及BUN的水平均明顯低于對照組，治療組小鼠治療后Cr及BUN水平較治療前均明顯升高(P<0.05)，損傷組及對照組治療后Cr及BUN水平與治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖1 各組小鼠腎臟病理檢測

表3 各組小鼠血清相關(guān)生化指標(biāo)情況(mg/dl)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 小鼠治療前后體內(nèi)氧化應(yīng)激水平變化情況 治療組及損傷組小鼠治療前SOD水平均明顯低于對照組，治療組小鼠治療后SOD水平較治療前明顯升高(P<0.05)，而損傷組及對照組小鼠治療后與治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎臟SOD水平比較(U/mg)

注：與對照組比較，*P<0.001(*1t=12.344，*2t=5.051，*3t=12.391，*4t=14.457)；#與損傷組比較，P<0.001(t=8.885)

治療組及損傷組小鼠治療前MDA、GSH水平均明顯高于對照，治療組小鼠治療后MDA、GSH水平較治療前明顯降低(P<0.05)，而損傷組及對照組小鼠治療后與治療前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5、表6。

表5 各組小鼠腎臟MDA水平比較(nmol/mg)

注：與對照組比較，*P<0.001(*1t=12.902，*2t=4.121，*3t=13.520，*4t=13.124)；#與損傷組比較，P<0.001(t=7.724)

表6 各組小鼠腎臟GSH水平比較(nmol/mg)

注：與對照組比較，*P<0.001(*1t=12.410，*2t=6.744，*3t=12.503，*4t=14.620)；#與損傷組比較，P<0.001(t=8.138)

3 討論

腎毒性在順鉑的不良反應(yīng)中出現(xiàn)的頻率最高，其他不良反應(yīng)還包括：骨髓抑制、耳毒性、胃腸道毒性和變態(tài)反應(yīng)[12-13]。研究表明，順鉑腎毒性的重要機(jī)制中包含氧化應(yīng)激的作用[14]。

在臨床祛痰藥物中，NAC出現(xiàn)的頻率很高。近年研究顯示，該藥物可作為氧化性的巰基供體影響細(xì)胞代謝作用，直接對自由基產(chǎn)生干擾和清除效果。故在臨床的診斷和實驗中(如神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、呼吸、AIDS等方面[15])，均具有更大的應(yīng)用潛力。隨著研究的深入，NAC也得到研究者的重視，特別是其抗氧化和預(yù)防組織損傷作用。對于包含肝損傷的組織損傷研究中，也證明NAC存在抗氧化治療作用[16]，但是對于腎損傷的影響，出現(xiàn)很多差異較大的結(jié)論。如在抗腎損傷藥物中，NAC具有很大程度的臨床價值[17]，不過有的研究也得到完全相反的結(jié)論[18]。所以，對于腎臟功能的提升，需要對NAC進(jìn)行更為深入的探索和研究。

在減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷方面，SOD作為關(guān)鍵酶具有保護(hù)和清除自由基作用[19]。SOD1不僅是SOD的主要形式，在細(xì)胞中也是高水平表達(dá)的SOD。經(jīng)過人工合成的PEP-1具有很多較好特性，如對血清不敏感、安全、無毒、高效等。作為一種細(xì)胞穿透肽能以非能量、非受體依賴性的方式，對很多物質(zhì)產(chǎn)生作用，如蛋白質(zhì)、肽段、寡核苷酸等，能夠?qū)⑦@些物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)[20-21]。在銅-鋅超氧化物中存在一種由基因工程制備的歧化酶，即SOD1。其最主要的作用為降低O2-產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，該歧化反應(yīng)在O2-作用下進(jìn)行。但是大分子物質(zhì)在生物學(xué)應(yīng)用上存在很多限制因素，如不存在特異性受體和通道，內(nèi)吞作用也不能作為進(jìn)入細(xì)胞的方式。故通過基因技術(shù)的研究，產(chǎn)生PEP-1-SOD1融合的蛋白，該蛋白能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入缺血/再灌注損傷的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

NAC是一種黏液溶解劑，作為臨床上常用的祛痰藥應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，而且具有抑制細(xì)胞凋亡的效果。PEP-1-SOD1具有直接且明顯的抗氧化應(yīng)激的效果，未見有研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對順鉑誘導(dǎo)影響急性腎損傷小鼠后氧化應(yīng)激水平的相關(guān)研究。本研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行治療，以期從降低氧化應(yīng)激水平和抗細(xì)胞凋亡水平對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠進(jìn)行雙方面保護(hù)，從而降低順鉑導(dǎo)致的急性腎損傷和氧化應(yīng)激水平，提高急性腎損傷小鼠治療效果。

本研究采用PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠模型進(jìn)行治療，PEP-1-SOD蛋白聯(lián)合NAC不但可以提高小鼠腎臟指數(shù)，降低小鼠腎臟損傷程度，并且可以提高體內(nèi)SOD水平，降低GSH、MDA水平，從而緩解機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的情況，降低機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。本研究為化療藥物順鉑所致急性腎損傷的治療、化療藥物的改進(jìn)提供了研究基礎(chǔ)及臨床依據(jù)。