胡 炯，王國強(qiáng)，劉啟明，董黎強(qiáng)*，羅統(tǒng)富

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以軟骨細(xì)胞代謝異常，引起軟骨細(xì)胞退變和軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞為主的慢性病。研究表明，關(guān)節(jié)軟骨組織的破壞以Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ)的平衡失常，過度分解尤為顯著[1-2]。在OA進(jìn)展中，軟骨細(xì)胞代謝失衡，對基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而MMP-13釋放至細(xì)胞外后活性啟動(dòng)，進(jìn)一步加重了基質(zhì)中collagen Ⅱ的降解，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織的損傷、退變，加快OA的發(fā)生發(fā)展[3-4]。染料木素(Genistein,Gen)又稱染料木黃酮、金雀異黃素，其為存在于異黃酮類中植物雌激素藥理活性最強(qiáng)的一種成分，因其化學(xué)構(gòu)建類似雌激素，故具備結(jié)合雌激素受體表現(xiàn)雌激素樣效應(yīng)的能力。研究表明，染料木素能夠調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的代謝，保護(hù)骨組織，延緩骨組織的退變[5]。因此，本研究通過觀察不同濃度染料木素對OA軟骨細(xì)胞增殖活性及分泌collagen Ⅱ、MMP-13水平的影響，探討染料木素在延緩OA中的機(jī)制，為治療OA提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器 人軟骨細(xì)胞購自江陰齊氏生物科技有限公司。染料木素(南京廣潤生物制品有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，細(xì)胞增殖-細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)(VICMED公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)，IL-1β(Recombinant proteins公司)，Anti-MMP-13 antibody、Anti-collagen Ⅱantibody(Affinity公司)，GAPDH(Bioworld公司)，戊酸雌二醇片(美國DELPHARM lille公司，批號(hào)：270A)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson公司)，凝膠成像儀(Bio-RAD公司)，酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，pH計(jì)(Metter-Toledo GmbH公司)，電泳儀電源和小型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 將人軟骨細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有胎牛血清的培養(yǎng)皿中，37 ℃ 5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到對數(shù)生長期。甲苯胺藍(lán)染色鑒定：培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS漂洗，將細(xì)胞置于4%多聚甲醛固定(室溫)20 min，PBS漂洗，3×5 min，1%甲苯胺藍(lán)染色液染色5 min；PBS漂洗，3×5 min；蒸餾水洗1 min，不同濃度酒精分別浸泡1 min；二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡5 min，晾干，加入中性樹膠，封片。顯微鏡下觀察。OA模型建立：將實(shí)驗(yàn)分為軟骨細(xì)胞組(A組)、軟骨細(xì)胞+IL-1β處理組(B組)2組。IL-1β終濃度為10 ng/ml，IL-1β誘導(dǎo)1×106軟骨細(xì)胞24 h。Western blot檢測：200 μl IP裂解液裂解軟骨細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，BCA試劑作用后，測定562 nm處的吸光度值，計(jì)算蛋白濃度，將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行沸水浴10 min，制備電泳膠后固定，依據(jù)Marker切下目的條帶，200 mA恒流電轉(zhuǎn)移，PVDF膜浸泡于4 ℃一抗孵育液中過夜，洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育1 h，加入ECL液化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.2 染料木素對OA模型軟骨細(xì)胞的影響 實(shí)驗(yàn)分組：分6組，A組：軟骨細(xì)胞組(對照組)；B組：軟骨細(xì)胞+IL-1β處理組；C組：軟骨細(xì)胞+IL-1β+染料木素(25 μg/ml)處理組；D組：軟骨細(xì)胞+IL-1β+染料木素(50 μg/ml)處理組；E組：軟骨細(xì)胞+IL-1β+染料木素(100 μg/ml)處理組；F組：軟骨細(xì)胞+IL-1β+戊酸雌二醇(100 μg/ml)處理組。CCK-8法檢測細(xì)胞活力：各組藥物分別作用0、24、48、72、96 h時(shí)，取出96孔板，棄去細(xì)胞上層培養(yǎng)基，每孔加入100 μl含0.5% FBS的新鮮培養(yǎng)基，再每孔加入10 μl CCK8，37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀，450 nm進(jìn)行讀數(shù)。按“1.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 人軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果分析 甲苯胺藍(lán)是一種堿性染料，組織中酸性物質(zhì)與陽離子結(jié)合顯藍(lán)色。正常人軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色后細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞核仁呈深藍(lán)色。本研究甲苯胺藍(lán)染色顯示培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞呈異染性，證實(shí)為人軟骨細(xì)胞。見圖1。

圖1 軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

2.2 OA模型建立及蛋白鑒定 Western blot檢測各組collagenⅡ和MMP-13蛋白水平。與A組比較，B組的MMP-13蛋白含量升高，collagen Ⅱ蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞蛋白含量比較

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 見圖2。加入不同濃度染料木素處理0 h即IL-1β處理24 h，與A組相比，細(xì)胞增殖能力下降，證明IL-1β處理減弱了細(xì)胞活力。染料木素處理24、48 h，與B組比較，D組細(xì)胞活力上調(diào)不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.160，P=0.163)，而E組細(xì)胞活力顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明染料木素濃度越高，對軟骨細(xì)胞活力促進(jìn)作用越強(qiáng)。染料木素處理72 h，與B組比較，D組和E組的細(xì)胞活力均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明濃度為50 μg/ml的染料木素對細(xì)胞活力的促進(jìn)作用隨時(shí)間的延長而逐漸明顯。結(jié)果表明，IL-1β處理可以減弱細(xì)胞活力；染料木素能顯著增強(qiáng)1L-1β處理的軟骨細(xì)胞增殖活力；并且細(xì)胞增殖活力隨染料木素濃度的增多而增強(qiáng)，且與時(shí)間呈正比。從表2可知，細(xì)胞活力在96 h時(shí)較72 h時(shí)未出現(xiàn)明顯的升高，表示細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)皿中逐漸達(dá)到飽和，抑制了細(xì)胞進(jìn)一步增殖，而72 h時(shí)組間體現(xiàn)出顯著差異，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇72 h作為檢測時(shí)間點(diǎn)。另外，IL-1β+100 μg/ml染料木素處理組與單獨(dú)加IL-1β處理組比較，OD值差距沒有擴(kuò)大，證明100 μg/ml染料木素具備較好的抑制IL-1β對細(xì)胞增殖的抑制作用。見表2。

表2 B、D、E三組增殖活力比較(%)

注：*D組與B組比較，#E組與B組比較

圖2 CCK-8檢測細(xì)胞活力

注：與A組比較,**P<0.01;與B組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 染料木素對OA模型軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白水平的影響 與軟骨細(xì)胞組比較，IL-1β處理使軟骨細(xì)胞中collagen Ⅱ表達(dá)水平降低，MMP-13表達(dá)水平升高；采用染料木素作用后，IL-1β處理的軟骨細(xì)胞中collagen Ⅱ表達(dá)水平升高，而MMP-13表達(dá)水平降低；同時(shí)，collagen Ⅱ蛋白水平隨著染料木素濃度的增加而升高，而MMP-13蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 各組細(xì)胞蛋白含量比較

注：**與A組比較，P<0.01；##與B組比較，P<0.01

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝異常，軟骨基質(zhì)平衡遭到破壞和降解是骨關(guān)節(jié)炎形成的主要因素[6]。collagen Ⅱ是軟骨細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，供應(yīng)軟骨細(xì)胞生存所需條件。汪建樣等[7]研究發(fā)現(xiàn)，生長分化因子通過刺激collagen Ⅱ的表達(dá)起到保護(hù)軟骨組織的作用。MMP-13是基質(zhì)蛋白酶中裂解關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中效應(yīng)最高的一種，最終造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷[8]。王偉東等[9]研究發(fā)現(xiàn)，右歸飲通過抑制軟骨細(xì)胞分泌MMP-13，減少對軟骨基質(zhì)的降解，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。

軟骨細(xì)胞上存在雌激素受體，是雌激素發(fā)揮效應(yīng)的靶細(xì)胞之一。雌激素調(diào)控軟骨代謝影響骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及進(jìn)程，刺激基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的生成，降低金屬基質(zhì)蛋白酶的含量，進(jìn)而延緩對關(guān)節(jié)軟骨的降解[10]，同時(shí)，雌激素能夠激發(fā)蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成分泌，維持軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保護(hù)軟骨，因此，雌激素對關(guān)節(jié)軟骨在多方面均有益處。雌激素替代療法能夠恢復(fù)絕經(jīng)后婦女雌激素水平，延緩骨質(zhì)疏松，減低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但顯著加大了子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因植物雌激素來源于天然植物，其使用的安全性較高，近年來，關(guān)于植物雌激素樣活性的研究報(bào)道越來越多，植物雌激素具備類似雌激素化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性的成分，能夠與人和哺乳動(dòng)物內(nèi)雌激素受體結(jié)合發(fā)揮其雌激素樣作用[11]。其中異黃酮類化合物是傳統(tǒng)中草藥內(nèi)含有的一類重要的天然有機(jī)化合物[12]，該化合物中植物雌激素樣效應(yīng)成分被當(dāng)作雌激素受體調(diào)節(jié)劑使用。染料木素是異黃酮類化合物中藥理活性最高的物質(zhì)。研究表明，染料木素能夠通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ來刺激成骨細(xì)胞的增殖分化活性[13]，同時(shí)，染料木素能夠刺激骨形成和抑制破骨細(xì)胞的增殖分化和骨吸收功能[14]。

本實(shí)驗(yàn)利用IL-1β誘導(dǎo)正常人軟骨細(xì)胞建立OA軟骨細(xì)胞模型，采用甲苯胺藍(lán)染色和Western blot檢測方法鑒定OA軟骨細(xì)胞模型的成功建立。CCK-8法檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞模型較正常軟骨細(xì)胞活力下降明顯，通過不同濃度染料木素處理后，IL-1β+軟骨細(xì)胞活性大大增強(qiáng)，染料木素濃度越高，細(xì)胞活力增強(qiáng)越明顯，以100 μg/ml染料木素處理組細(xì)胞活力最強(qiáng)。在藥物處理72 h時(shí)，100 μg/ml染料木素處理組較正常軟骨細(xì)胞組細(xì)胞活性差距最小。100 μg/ml染料木素與雌二醇處理后，染料木素藥理效應(yīng)更強(qiáng)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，染料木素濃度越高，OA細(xì)胞模型中生成的collagen Ⅱ越高，而MMP-13含量逐漸下降。100 μg/ml濃度染料木素處理OA細(xì)胞較雌二醇處理達(dá)到更好的效果。提示雌二醇與染料木素均能夠延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，100 μg/ml染料木素延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展效果最佳，且同等濃度下染料木素藥理效應(yīng)優(yōu)于雌二醇。

本實(shí)驗(yàn)染料木素通過刺激骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性，促進(jìn)collagen Ⅱ的合成和分泌，抑制軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP-13來達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、延緩骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的作用。但影響OA的發(fā)病機(jī)制眾多，染料木素是否同時(shí)參與其他因子的表達(dá)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，需要進(jìn)一步的研究。