（武漢市公安司法鑒定中心，湖北 武漢 430024）

2015年6月1日晚，長江監(jiān)利段“東方之星”客輪發(fā)生特大翻沉事件，遇難者達(dá)442人，受天氣炎熱、打撈工作復(fù)雜等影響，遇難者遺體腐敗很快，心血、肌肉等常規(guī)檢材已經(jīng)無法提取到DNA，如何快速有效地進(jìn)行DNA檢驗對客輪翻沉事件的尸源認(rèn)定具有重要意義。肋軟骨因其相對不易腐敗、易于前處理等特點(diǎn)在腐敗尸體DNA檢驗中成為首選生物檢材[1]。筆者通過對肋軟骨樣品使用GlobalFiler?系統(tǒng)經(jīng)直接擴(kuò)增法檢驗DNA，積累了一些經(jīng)驗，供法醫(yī)同行們參考。

1 材料與方法

樣本選自“東方之星”客輪翻沉事件遇難者中死亡時間在4～12d的10例高度腐敗遇難者尸體肋軟骨。

GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司）檢驗組：取上述10份肋軟骨樣本于擴(kuò)增管中，分別加入預(yù)先配制好的GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增體系 25 μL，包括反應(yīng)混合液 7.5 μL、引物混合物2.5μL、去離子水15μL。離心除氣泡后按操作手冊推薦的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。

GoldeneyeTM20A試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］對照組：取上述10份肋軟骨樣本于擴(kuò)增管中，按照GoldeneyeTM20A試劑盒說明書選取25 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增[2]。

所有樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行電泳，用GeneMapper?ID-X軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）對各原始電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行STR基因分析，設(shè)定峰高閾值≥50相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）作為分析標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

20份肋軟骨樣本均獲得了全部基因座的分型結(jié)果。經(jīng)GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒得到的10個樣本（編號1～10）的PCR產(chǎn)物，各基因座峰高為（4 826.90±1 591.66）RFU，等位基因雜合子峰高比為0.88±0.02（表1）。 經(jīng)GoldeneyeTM20A 試劑盒得到的10個樣本的PCR產(chǎn)物各基因座峰高為（4425.50±1 276.47）RFU，等位基因雜合子峰高比為0.87±0.03（表 1）。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒和GoldeneyeTM20A試劑盒在整體峰值高度、各基因座之間平衡性均表現(xiàn)良好。

表1 兩種試劑盒各基因座的檢查結(jié)果

本研究結(jié)果表明，使用GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增對肋軟骨具有較好的可行性。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增法與常規(guī)的提取、擴(kuò)增、電泳流程相比縮短了約3 h，與GoldeneyeTM20A試劑盒相比，擴(kuò)增時間節(jié)省約2 h。同時減少耗材使用，降低了成本，也避免了外源性污染的可能，為及時、準(zhǔn)確地獲得死者身源信息提供了保障。在這類腐敗嚴(yán)重的生物檢材中通常含有較多對PCR產(chǎn)生抑制的物質(zhì)[1]，為克服抑制物的影響，Global-Filer?Express PCR擴(kuò)增試劑盒改進(jìn)了PCR所需緩沖液配方，使其能更有效地釋放DNA[2]。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒具有24個位點(diǎn)，其中含10個miniSTR位點(diǎn)，對腐敗降解檢材具有更強(qiáng)的抗抑制能力[3]。肋軟骨采用GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增法獲得了良好的基因座分型，并且在整體峰值高度、雜合子平衡性、熒光峰相對熒光強(qiáng)度值在各基因座間平衡性方面均表現(xiàn)良好。同時，國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒也表現(xiàn)不俗，在控制成本上具有一定優(yōu)勢，樣本量大的情況下可節(jié)省開支，實(shí)驗室可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

[1]竇雪麗，陳紅英，牛蕾蕾，等.PowerPlex?16 HS系統(tǒng)直接擴(kuò)增法檢測肋軟骨[J].刑事技術(shù)，2014（5）：6-8.

[2]王潔，黃艷梅，張慶霞，等.國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒性能指標(biāo)驗證[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（1）：12-15.

[3]路志勇，薛盧艷，張慶霞，等.GlobalFiler?PCR擴(kuò)增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（4）：273-276.