張 洪 達， 楊 帆， 薛 婷 婷

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

異麥芽酮糖 (α-D-吡喃葡糖基-1,6-D-果糖)，又稱帕拉金糖，由葡萄糖和果糖以α-1,6 糖苷鍵鏈接形成的還原性二糖，是一種蔗糖異構(gòu)體[1]。異麥芽酮糖具有非致齲齒性、益生元特性等生理功能，適合糖尿病人食用，同時對大多數(shù)細菌和酵母具有抑制作用，可作為一種健康的食品添加劑，替代蔗糖應用于食品工業(yè)[2]。目前，異麥芽酮糖的發(fā)酵生產(chǎn)遇到諸如生產(chǎn)菌株蔗糖異構(gòu)酶活性較低造成的異麥芽酮糖產(chǎn)量低、發(fā)酵液黏度大造成的產(chǎn)物分離困難及生產(chǎn)成本較高等問題。

和傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP 誘變對遺傳物質(zhì)的損傷機制多樣，獲得突變型多樣性的可能性較大。本實驗室在前期工作中分離獲得一株能夠生產(chǎn)異麥芽酮糖的克雷伯氏菌，該菌株所產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶可催化蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，同時生成少量的海藻酮糖，幾乎沒有葡萄糖和果糖[3]。本研究采用ARTP誘變技術(shù)對菌株進行誘變，篩選得到一株性能優(yōu)異且遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)異麥芽酮糖突變株，以期為異麥芽酮糖工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

Klebsiellasp. LX3，分離自新加坡的土壤樣品，菌種保藏于本實驗室-80 ℃冰箱。

固體培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 40，酵母浸粉 5，MgSO4·3H2O 0.5，KNO30.7，K2HPO45.0，NH4Cl 0.5，NaCl 5.0，瓊脂20；pH 7.0。 種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 40，蛋白胨 10，酵母浸粉 4；pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 40，蛋白胨 10，酵母浸粉 4；pH 7.0。培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌30 min。

1.2 材料與儀器

ARTP誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀；依利特C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

1.3 原始菌株生長曲線的建立

將Klebsiellasp.LX3在固體培養(yǎng)基上進行活化，30 ℃培養(yǎng)24 h，取一環(huán)活化菌種接入種子培養(yǎng)基，于160 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。將種子液以5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)。12 h內(nèi)每隔1 h取樣，12～24 h 每隔2 h取樣，24 h后每隔4 h取樣。每個取樣點設(shè)置3個平行樣，繪制菌株生長曲線[4]。

1.4 ARTP誘變處理及正向突變菌株的篩選

1.4.1 菌懸液的制備

從活化的固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基中，于160 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，將種子液以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，以相同條件培養(yǎng)至對數(shù)期后，取1 mL菌液于6 000g、4 ℃離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3遍，用5%甘油重懸至菌液OD600為1.0[5]。

1.4.2 ARTP誘變

將10 μL菌懸液均勻涂布在金屬載片的上表面。采用高純氦氣作為等離子體的工作氣體，電源功率100 W，照射距離2 mm，等離子體溫度小于35 ℃，氣體體積流量10 L/min，處理時間分別為0、10、15、20、25、30、35、40、50 s，樣品誘變完畢后，放至裝有990 μL、5%甘油的EP管中。在混勻儀上振蕩1 min，把附著在菌物載片上的微生物洗脫到液體中，形成新的菌懸液。適當稀釋，取200 μL 稀釋液涂布到平板上，取樣過程中注意振蕩菌液以保持均勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。使用平板計數(shù)法計數(shù)，計算致死率并繪制曲線[6]。

致死率=(N0-N1)/N0×100%

式中：N0為誘變前的總菌數(shù)，N1為誘變后存活的菌數(shù)。

1.4.3 正向突變菌株的篩選

在選定的誘變劑量下進行誘變處理，將誘變后制得的菌懸液稀釋適當倍數(shù)，涂布于平板上。于30 ℃培養(yǎng)24 h，篩選出菌落黏度較低、形態(tài)均勻的單菌落突變。將目標菌分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min過夜培養(yǎng)。篩選發(fā)酵液中還原糖含量高且發(fā)酵產(chǎn)物為單一異麥芽酮糖的突變株進行第二輪誘變，進一步篩選出酶活最高且發(fā)酵液黏度較低的高產(chǎn)突變株。利用HPLC檢測異麥芽酮糖產(chǎn)量[7]。

1.5 DNS法測定蔗糖異構(gòu)酶的酶活

取500 μL發(fā)酵液離心清洗。取50 μL菌懸液與450 μL、40 g/L蔗糖底物于37 ℃水浴15 min，按照DNS方法測定釋放出的還原糖量，并計算比酶活。酶活定義：在上述條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化蔗糖為1 μmol還原糖(以異麥芽酮糖計)所需的酶量，定義為1 U[8]。

1.6 薄層層析法檢測發(fā)酵產(chǎn)物成分

取培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液樣品1 mL，于4 ℃、10 000g離心10 min，取上清液稀釋至適當倍數(shù)，點TLC板。用體積比3∶12∶4的正丁醇、異丙醇、水混合溶劑展開，用苯胺二苯胺丙酮磷酸試劑在80 ℃顯色5 min[9]。

1.7 絮凝效果的檢測

取1 mL發(fā)酵液稀釋50倍后，加入80 μL的殼聚糖絮凝劑，室溫下靜置30 min，取上清液測600 nm處的吸光度。加入殼聚糖絮凝劑后計算菌體的去除率[10]。

去除率=(1-A1/A0)×100%

A1=A2V1/V0

式中：A0為原始菌液的OD600；A1為絮凝后實際上清液的OD600；A2為絮凝后測得上清液的OD600；V1為上清液體積，mL；V0為加入殼聚糖后溶液總體積，mL。

1.8 HPLC測定發(fā)酵液產(chǎn)物

將發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋適當倍數(shù)后過濾，濾液用HPLC測定產(chǎn)物含量。HPLC檢測條件：依利特C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：超純水，體積流量1 mL/min；柱溫箱30 ℃，進樣量10 μL。

1.9 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性測定

發(fā)酵液于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，每12 h傳代一次，共6次。每次取樣1 mL，離心后取上清稀釋適當倍數(shù)，HLPC測定異麥芽酮糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生菌株生長曲線的繪制

由圖1可知，菌株LX3在2.5～3 h達到對數(shù)生長中期，故選擇該時期為菌株最佳誘變時間。

圖1 野生型菌株 LX3的生長曲線Fig.1 The growth curve of the wild type of strain LX3

2.2 ARTP誘變劑量的確定

ARTP誘變的致死亡率曲線如圖2所示。在0～20 s，隨著照射處理時間的延長，菌體死亡率快速上升；20～30 s，隨著照射時間的延長，致死率緩慢上升；當照射處理時間為25 s時，致死率為90%；當照射處理時間為30 s時，死亡率達到100%。為了能夠同時得到較高的正突變率和較大的突變幅度，確定誘變時間為25 s。

圖2 ARTP誘變的致死率曲線Fig.2 The fatality rates of ARTP mutation

2.3 異麥芽酮糖高產(chǎn)菌株的篩選

按照方法“1.4”對菌株LX3進行誘變處理，在突變株中挑選發(fā)酵液黏度低、菌落均勻的菌株，將得到的正突變菌株進行培養(yǎng)，12 h后測定蔗糖異構(gòu)酶的酶活。通過對突變株的篩選，共獲得6株酶活力明顯提高的菌株，分別命名為T1、T2、T3、T4、T5、T6，酶活測定結(jié)果如圖3所示。

圖3 突變型菌株的蔗糖異構(gòu)酶酶活Fig.3 Sucrose isomerase activities of the mutant types

如圖3所示，6株突變株的酶活力均有不同程度提高，其中突變菌株T2(命名為LX3-1)蔗糖異構(gòu)酶活力最高，達到112.19 U/mL，較野生型菌株提高了17.39%。

2.4 LX3-1產(chǎn)異麥芽酮糖的能力

將突變株和野生菌株培養(yǎng)12 h后，分別測定蔗糖異構(gòu)酶活力、絮凝后菌體去除率及發(fā)酵液異麥芽酮糖產(chǎn)量。由圖4可知，LX3-1和LX3對應的蔗糖異構(gòu)酶活力分別為106.88和88.57 U/mL，LX3-1酶活力較LX3提高了20.67%。加入絮凝劑后，LX3-1和LX3的絮凝去除率分別為40.7%和33.8%，表明LX3-1發(fā)酵液黏度略有降低，便于工業(yè)上菌體與產(chǎn)物的分離。

利用HPLC對出發(fā)菌株LX3和突變菌株發(fā)酵液中的異麥芽酮糖進行測定，結(jié)果如圖4所示，LX3發(fā)酵液中的異麥芽酮糖質(zhì)量濃度為0.024 6 g/L，LX3-1發(fā)酵液中異麥芽酮糖質(zhì)量濃度為0.034 9 g/L。突變菌株LX3-1發(fā)酵液中的異麥芽酮糖含量明顯高于出發(fā)菌株LX3，提高了41.87%。

圖4 LX3-1和LX3的蔗糖異構(gòu)酶活力、絮凝去除率及異麥芽酮糖產(chǎn)量對比Fig.4 Comparision of sucrose isomerase activities, removal rates and isomaltulose contents of LX3-1 and LX3

TLC鑒定結(jié)果如圖5所示。LX3和 LX3-1點板結(jié)果均為黃綠色，證明產(chǎn)物是異麥芽酮糖，黑色的底物蔗糖以及副產(chǎn)物葡萄糖和果糖幾乎沒有，表明底物蔗糖完全轉(zhuǎn)化。

1,葡萄糖；2,蔗糖；3,異麥芽酮糖；4,LX3；5,LX3-1

2.5 LX3-1的遺傳穩(wěn)定性

選出產(chǎn)異麥芽酮糖最高的誘變菌株進行連續(xù)傳代，考察其產(chǎn)異麥芽酮糖的穩(wěn)定性。由表1可見，6代突變株的異麥芽酮糖產(chǎn)量在2.782～3.031 g/L，蔗糖異構(gòu)酶的酶活力為96.84～101.33 U/mL，無明顯變化，表明LX3-1傳代6次對發(fā)酵無明顯影響，說明LX3-1遺傳穩(wěn)定性好。

表1 LX3-1的遺傳穩(wěn)定性Tab.1 The genetic stability of LX3-1

3 結(jié) 論

本實驗通過對LX3進行誘變篩選，得到了一株異麥芽酮糖產(chǎn)量較高、黏度較低且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株LX3-1。與野生型相比，LX3-1蔗糖異構(gòu)酶活力為106.88 U/mL，較LX3提高了20.42%。絮凝后菌體去除率為40.7%，較LX3提高了6.9%。與LX3菌株相比，突變株的發(fā)酵液黏度略有降低，細胞更易與絮凝劑結(jié)合,異麥芽酮糖產(chǎn)物易于分離。LX3-1異麥芽酮糖產(chǎn)量為2.898 g/L，較LX3提高了41.87%,異麥芽酮糖產(chǎn)量明顯增加。經(jīng)過6次傳代培養(yǎng)，證明LX3-1是一株遺傳性狀穩(wěn)定、產(chǎn)異麥芽酮糖能力強的菌株。