梁 帥， 王 晗， 陳 珺， 簡 路 洋，郭 琦， 肖 珊， 劉 冰 南， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

反式脂肪酸(TFA)是一類含有反式構(gòu)型雙鍵的脂肪酸[1]。食物中反式脂肪酸的來源主要有4種：(1)反芻動(dòng)物瘤胃中微生物的轉(zhuǎn)化；(2)植物油的氫化；(3)多不飽和脂肪酸含量高的植物油或魚油精煉脫臭工藝；(4)烹飪時(shí)油溫過高[2]。食物中反式脂肪酸的主要形式是反油酸(9t-18：1)、反亞油酸(9t，12t-18：2)以及反異油酸(11t-18：1)。

油脂的氫化是反式脂肪酸的主要來源，氫化豆油常在巧克力、冰激凌、糕點(diǎn)等食品中使用，是人們?nèi)粘ｏ嬍硵z入反式脂肪酸的主要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)，反式脂肪酸會(huì)增加人體血液中的低密度脂蛋白含量，增加動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)[4]。在對(duì)心臟病患者和健康人的體脂中發(fā)現(xiàn)，心臟病患者體內(nèi)的反式脂肪酸的含量明顯高于健康人[5]。有研究證據(jù)顯示，反式脂肪酸具有較強(qiáng)的全身致炎作用[6]，同時(shí)TFA會(huì)抑制甘油三酯的合成，干擾正常脂肪酸的代謝，因此會(huì)對(duì)發(fā)育產(chǎn)生影響[7]。白細(xì)胞介素-8(IL-8)是一種能激活嗜中性粒細(xì)胞的趨化性細(xì)胞因子[8]。主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在TNF-α和外源性因子的刺激下產(chǎn)生[9]。IL-8對(duì)腸道免疫屏障功能具有重要作用[10]。目前，加工產(chǎn)生的反式脂肪酸對(duì)腸道健康的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究了飼料中添加氫化豆油對(duì)小鼠小腸脂肪酸組成以及IL-8表達(dá)量的影響，以期為反式脂肪酸影響腸道功能的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BF3-CH3OH溶液，美國Sigma；反油酸甲酯、反異油酸甲酯、反亞油酸甲酯、共軛亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma；AIN-93飼料，江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司；全蛋白提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；抗IL-8單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；酶標(biāo)儀，Thermo Multiskan GO。

1.2 脂肪酸組成檢測(cè)

將食用油用氯仿-甲醇溶液萃取，脂肪酸提取物在堿性條件下進(jìn)行皂化，再加入14%的BF3-CH3OH 溶液甲酯化。使用GC-MS氣相色譜測(cè)定脂肪酸甲酯的組成。GC-MS檢測(cè)條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：120 ℃，3 min；8 ℃/min升溫至175 ℃維持28 min；3 ℃/min升溫至220 ℃ 維持28 min[11-12]。使用反油酸甲酯、反異油酸甲酯、反亞油酸甲酯、共軛亞油酸甲酯等標(biāo)準(zhǔn)品，采用峰面積歸一化法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 小鼠實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的純系小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。均為3周齡斷乳鼠，隨機(jī)分為壓榨大豆油組(對(duì)照組)和氫化豆油組，每組4只。

1.3.2 飼料制備

將AIN-93飼料與實(shí)驗(yàn)油脂混合攪拌機(jī)攪拌均勻制成塊狀飼料，-20 ℃保存[13]。飼料配比見表1。

表1 小鼠飼料組成Tab.1 The component of mouse feed %

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)壓榨大豆油組(對(duì)照組)和氫化豆油組(實(shí)驗(yàn)組)。每組小鼠(3周齡)稱重并測(cè)量尾長，在18～22 ℃動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)，喂食普通飼料，保證飲用水供給適應(yīng)環(huán)境3 d。

各組小鼠每天分別投放對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料，自由采食，保證飲用水供給，每2 d更換一次墊料，保持飼養(yǎng)溫度18～22 ℃，飼養(yǎng)至8周齡(成年)。

1.3.4 小鼠生長指標(biāo)監(jiān)測(cè)

每只小鼠每7 d測(cè)量體重和尾長，至8周齡。

1.3.5 樣品采集

各組小鼠飼養(yǎng)至8周齡進(jìn)行樣品采集。實(shí)驗(yàn)前斷食12 h，清理籠中殘留飼料，以減少腸道中殘留食糜對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

小鼠用頸椎脫臼法處死并解剖。取小鼠小腸(回腸)組織，用生理鹽水沖去腸道內(nèi)食糜等，分裝于凍存管中，樣品液氮速凍后置-80 ℃冰箱中保存待用[14]。

1.4 小鼠小腸脂肪酸組成檢測(cè)

將小鼠小腸組織剪碎，加入氯仿-甲醇溶液破碎并萃取，脂肪酸提取物在堿性條件下進(jìn)行皂化再加入14% BF3-CH3OH溶液甲酯化。使用氣相色譜測(cè)定脂肪酸甲酯的含量，GC-MS檢測(cè)條件同“1.1”。采用峰面積歸一化法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 小鼠小腸IL-8含量檢測(cè)

1.5.1 小鼠小腸組織蛋白提取

將100 mg組織剪碎，用PBS緩沖液洗滌兩次，3 500 r/min、4 ℃離心10 min。取沉淀后加入0.5 mL含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的Lysis buffer，4 ℃勻漿裂解組織。13 000 r/min、4 ℃ 離心10 min取上清液，分裝至預(yù)冷離心管中，即為全蛋白提取物，-80℃保存待用。

1.5.2 小鼠小腸組織蛋白濃度檢測(cè)

BCA法是目前常用蛋白濃度檢測(cè)方法之一。實(shí)驗(yàn)使用現(xiàn)配制的BCA液與稀釋后的蛋白提取液37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀在562 nm波長下比色，根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白含量，計(jì)算樣品蛋白濃度。

1.5.3 小鼠小腸組織IL-8含量檢測(cè)

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠小腸組織IL-8含量。提取的小鼠小腸組織蛋白提取液適當(dāng)稀釋后加入抗IL-8單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，定容至20 μL，37 ℃溫育后洗去未結(jié)合的成分。加入HRP標(biāo)記的IL-8抗體，37 ℃溫育后洗去未結(jié)合的成分。加入顯色劑顯色，在450 nm測(cè)定樣品吸光度，630 nm測(cè)定空白孔吸光度。計(jì)算后通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-8含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Student’st-test進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)食用油的脂肪酸組成

使用壓榨大豆油與氫化豆油作為壓榨大豆油組(對(duì)照組)和氫化豆油組實(shí)驗(yàn)用油，兩種食用油的脂肪酸成分GC-MS檢測(cè)結(jié)果如表2所示。氫化豆油中反-十八碳一烯酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.48%，顯著高于壓榨大豆油；反亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.26%，高于對(duì)照組，但含量較少。兩組小鼠飼料油脂中壓榨大豆油添加量分別為100%和80%，計(jì)算得氫化豆油組中亞油酸(n-6)與α-亞麻酸(n-3) 質(zhì)量比為5∶1，滿足小鼠正常生長所需。

2.2 小鼠小腸反式脂肪酸組成

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)至8周齡，取小腸組織，提取脂肪酸經(jīng)GS-MS檢測(cè)比較有代表性的反式脂肪酸和共軛亞油酸檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表2 實(shí)驗(yàn)食用油的脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid compositions of edible oil for the experiment %

如圖1(a)所示，經(jīng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組飼料飼養(yǎng)35 d后，氫化豆油組小鼠小腸反-十八碳一烯酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.79%，顯著高于壓榨大豆油組的0.12%(P<0.01)。氫化豆油組飼料油脂中的反-十八碳一烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.90%，與小腸組織中的含量接近，表明小腸組織中的反式脂肪酸主要來源于飲食。

如圖1(b)所示，氫化豆油組小鼠小腸反油酸(t9-18：1)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95%，顯著高于對(duì)照組的0.11%(P<0.01)；氫化豆油組小鼠小腸反異油酸(t11-18：1)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.61%，對(duì)照組未檢出反異油酸成分。反油酸和反異油酸是氫化豆油組小鼠小腸反-十八碳一烯酸的主要成分，分別占反-十八碳一烯酸的34.10%及21.83%。

如圖1(c)所示，氫化豆油組小鼠小腸共軛亞油酸(CLA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%，顯著高于對(duì)照組0.08%(P<0.01)。有研究表明，反異油酸可以在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為c9，t11-18：2共軛亞油酸[15]，因此推測(cè)氫化豆油組共軛油酸可能來源于飼料油脂和體內(nèi)轉(zhuǎn)化。

(a) 反-十八碳一烯酸

2.3 小鼠生長指標(biāo)

飲食會(huì)對(duì)小鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，體重和尾長是評(píng)價(jià)小鼠生長情況的常用指標(biāo)。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠生長過程3～8周齡中的體重和尾長進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果見圖2。

如圖2(a)所示，氫化豆油組小鼠食用含有氫化豆油的飼料5周后，體重增長率為331.52%，壓榨大豆油組298.75%，兩組的體重增長率差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，氫化豆油的攝入對(duì)小鼠有明顯的增重作用，因此推斷氫化豆油攝入所致小鼠體重增加可能與氫化豆油中反式脂肪酸含量較高有關(guān)。

如圖2(b)所示，壓榨大豆油組和氫化豆油組小鼠尾長增長率分別為128.68%和134.41%，并無顯著差異(P>0.05)。表明反式脂肪酸對(duì)小鼠尾長無明顯影響。

(a) 體重

(b) 尾長

氫化豆油組小鼠的體重增長更快，而尾長增長率無顯著差異。因此氫化豆油的攝入可能并未促進(jìn)小鼠的生長，而只是增加了小鼠的體重。研究表明，反式脂肪酸升高血液中膽固醇含量，增大心血管疾病和胰島素抗性甚至糖尿病的發(fā)病幾率，導(dǎo)致肥胖。由此推測(cè)氫化豆油組小鼠的體重較對(duì)照組的差異可能與反式脂肪酸促進(jìn)肥胖的影響有關(guān)。

2.4 小鼠小腸組織IL-8含量

ELISA法檢測(cè)小鼠小腸組織IL-8的含量如圖3所示。氫化豆油組小鼠小腸IL-8質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.91 pg/g，低于壓榨大豆油組的23.51 pg/g(P<0.05)。結(jié)果顯示，氫化豆油攝入增加了小鼠小腸總反-十八碳一烯酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.79%)，顯著高于壓榨大豆油組(0.12%)。現(xiàn)有的研究表明，IL-8在腸道免疫功能中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著反-十八碳一烯酸含量的增加，氫化豆油組小鼠腸道IL-8顯著降低，提示氫化豆油的攝入引起腸道反式脂肪酸增加可能干擾小鼠腸道免疫功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，氫化豆油組小鼠小腸CLA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加(0.32%)，是壓榨豆油組的4倍。有研究表明，雖然CLA可能對(duì)機(jī)體的免疫狀態(tài)有一定的調(diào)節(jié)作用，對(duì)促進(jìn)免疫平衡具有有益的影響，但是氫化豆油組小腸反-十八碳一烯酸含量顯著增高，約是壓榨豆油組的23倍；而且在氫化豆油組，反-十八碳一烯酸的含量顯著高于CLA含量，約為CLA的9倍。因此，在氫化豆油攝入影響小鼠IL-8表達(dá)的作用中，綜合反式脂肪酸和CLA的影響，表明反式脂肪酸可能發(fā)揮了主導(dǎo)作用。

圖3 小鼠小腸IL-8的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Content of IL-8 in small intestine of mice

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了氫化豆油攝入對(duì)小鼠腸道脂肪酸組成及IL-8表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)氫化豆油組小鼠小腸組織中反-十八碳一烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.79%，顯著高于對(duì)照組0.12%。氫化豆油組小鼠小腸組織的IL-8質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.91 pg/g，顯著低于對(duì)照組23.51 pg/g。氫化豆油組小鼠小腸IL-8表達(dá)的降低可能與氫化豆油中反式脂肪酸的攝入所致的小腸反式脂肪酸增加有關(guān)，其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。