佟桂芝，韓永勝，王洪寶，李信濤，王偉霞，宋 斌，李玉龍

（1.黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

國(guó)外采用性控冷凍精液進(jìn)行體外性控胚胎生產(chǎn)的研究較早，目前囊胚率能達(dá)到50%左右[1-2]。我國(guó)在該項(xiàng)領(lǐng)域的研究起步較晚，但國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)不斷改善優(yōu)化牛體外性控胚胎的生產(chǎn)體系，目前我國(guó)的體外受精囊胚率已達(dá)到25%左右[3-5]。針對(duì)牛良種快速擴(kuò)繁的實(shí)際需求及采用性控冷凍精液體外受精生產(chǎn)性控胚胎效率較低、成本較高的現(xiàn)狀，該試驗(yàn)系統(tǒng)地比較了性控精液體外獲能方法、獲能液及體外受精液添加抗壞血酸、卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞部分脫除對(duì)性控精液體外受精性控胚胎發(fā)育率的影響，進(jìn)而為提高體外性控牛胚胎生產(chǎn)效率提供技術(shù)基礎(chǔ)。該試驗(yàn)以牛體外受精性控胚胎為研究對(duì)象，在體外受精的過(guò)程中添加抗壞血酸，統(tǒng)計(jì)性控胚胎的體外受精卵裂率、囊胚率，旨在證明抗氧化劑在提高牛性控凍精體外受精早期胚胎發(fā)育中的功能。

表1 精子不同體外獲能方法對(duì)體外受精效果的影響

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試驗(yàn)中所涉及的生化試劑除特別標(biāo)注外均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 卵母細(xì)胞的收集

在牛屠宰場(chǎng)，用無(wú)菌剪刀剪取剛屠宰后牛的新鮮卵巢，用含1 000 IU/L青霉素和1 000 IU/L鏈霉素的滅菌生理鹽水沖洗干凈，放入含有雙抗的32℃生理鹽水中，在2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用無(wú)菌剪刀剪掉周圍的脂肪等組織后用預(yù)熱加有雙抗的生理鹽水沖洗牛卵巢3次以上，用10 mL的帶有12#針頭的一次性注射器抽取卵巢上直徑為2～8 mm卵泡的卵泡液，獲得的卵泡液置于15mL離心管內(nèi)。放在預(yù)熱至38.5℃的恒溫臺(tái)。分別取直徑3.5 cm培養(yǎng)皿4個(gè)、直徑9 cm培養(yǎng)皿2個(gè)，將直徑9 cm的培養(yǎng)皿底部劃上寬度間隔約為0.7 cm的直線。將含有COCs的采卵液（15 mL離心管內(nèi)）倒入培養(yǎng)皿中，并輕輕搖勻。然后在體視顯微鏡下收集卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體 （cumulus oocyte complex，COCs），并移入盛有抽卵液的直徑3.5 cm培養(yǎng)皿中。形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻和卵丘細(xì)胞不低于3層的COCs為可用。用預(yù)平衡的卵母細(xì)胞成熟液清洗5次。采卵液配方：mPBS（0.665 g/L肝素鈉、10%FBS、100 IU/L 青霉素、100 IU/L 鏈霉素）。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

在體視鏡下檢出卵母細(xì)胞，然后選出A、B級(jí)卵母細(xì)胞，放入在培養(yǎng)箱預(yù)平衡2 h以上，4孔培養(yǎng)板進(jìn)行體外成熟（500 μL/孔），每孔放50枚A、B級(jí)卵丘—卵母細(xì)胞 （COCs）。成熟液TCM-199[10 μg/mL 促性腺激素（FSH）、8% 胎牛血清（FCS）、1 μg/mL 雌二醇（E2）、1 μg/mL 促黃體激素（LH）、1 mmol/L L-谷氨酰胺、20 ng/mL EGF、100 μmol/L半胱氨酸]，體外成熟24 h。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。

1.4 精子獲能及體外受精

1.4.1 精子離心體外獲能法：牛性控冷凍精液在38℃水浴中解凍15 s，然后將解凍后的精液貼壁緩慢加入獲能液，然后進(jìn)行離心（2 000 r/min，5 min），一次離心體外獲能法在此時(shí)去上清液后，直接用受精液將精子密度稀釋至1×106個(gè)/mL用于體外受精，二次離心體外獲能法離心沉淀后的精子團(tuán)用 5 mL獲能液（1 000 r/min，5 min）再離心 1次。去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至1×106個(gè)/mL用于體外受精。性控精子體外獲能液BO液：10 mg/L 咖啡因、5 μmol/L 抗壞血酸、3 mg/mL BSA。

1.4.2 精子上浮獲能法：用加樣器槍頭輕輕把解凍后的精液貼壁加入離心管底部的獲能液中，然后把離心管放入培養(yǎng)箱上浮30 min進(jìn)行體外獲能。性控精子體外獲能液BO液：0.665 g/L肝素鈉、50 mol/L抗壞血酸、3 mg/mL BSA。

1.4.3 部分脫除卵丘細(xì)胞：體外成熟后的卵母細(xì)胞用0.1%的透明質(zhì)酸酶處理3 min，部分脫除卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞外仍然保留1～3層的卵丘細(xì)胞，這樣有利于性控精液的穿卵過(guò)程。

1.4.4 體外受精：受精前2 h做好受精液小滴，每滴50μL，放入CO2培養(yǎng)箱中平衡。在精子處理的同時(shí)，用200 μL移液器反復(fù)吹打培養(yǎng)成熟的COCs。使卵子間相互分離。洗滌5次后，將20個(gè)COCs移入受精液滴中。然后將培養(yǎng)皿放入38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外受精。體外受精液BO液：0.665 g/L肝素鈉、10 mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗壞血酸、3 mg/mL BSA。

1.5 體外胚胎發(fā)育培養(yǎng)（IVC）

1.5.1 胚胎發(fā)育液預(yù)平衡：在4孔培養(yǎng)板上標(biāo)記組別、日期，每孔放入胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液600 μL，覆蓋石蠟油。另取1.5 mL離心管，吸取1 mL的胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液放入離心管中，做好標(biāo)記。將4孔培養(yǎng)板和離心管放入38.5℃、飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中，預(yù)平衡2 h。mCR1aa：2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2 mmol/L的谷氨酰胺；胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液：mCR1aa液+3 mg/mL BSA。

表2 獲能液和體外受精液添加抗壞血酸對(duì)體外受精效果的影響

表3 部分脫除卵丘細(xì)胞對(duì)牛體外受精性控胚胎發(fā)育的影響

然后在胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液（預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2 h）中洗滌3次后，然后按每滴50個(gè)卵子移入500 μL 的 IVC 液 4 孔培養(yǎng)板中，在 5%O2、5%CO2、90%N2，飽和濕度條件下進(jìn)行早期胚胎體外培養(yǎng)。

1.5.2 更換培養(yǎng)液：受精卵于受精48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率后轉(zhuǎn)移至600 μL的胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔2 d半量換胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液。4孔培養(yǎng)板放入 38.5 ℃、飽和濕度的 5%O2、5%CO2、90%N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于受精第7～8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。胚胎發(fā)育培養(yǎng)Ⅱ液配方：mCR1aa液+10%FBS。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 精子不同體外獲能方法對(duì)體外受精效果的影響

性控冷凍精液解凍后按照3種不同的方法進(jìn)行精子體外獲能，然后按常規(guī)程序進(jìn)行體外受精和早期胚胎體外培養(yǎng)。由表1可知，精子上浮獲能法體外受精卵裂率、囊胚率均顯著高于二次離心體外獲能法（P＜0.05），但與一次離心體外獲能法無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 獲能液和體外受精液添加抗壞血酸對(duì)體外受精效果的影響

由表2可知，性控冷凍解凍精子獲能液和體外受精液添加1.0%抗壞血酸組體外受精卵裂率、囊胚率顯著高于不添加抗氧化劑組體外受精卵裂率、囊胚率（P＜0.05），但添加0.5%抗壞血酸組及添加1.5%抗壞血酸組與不添加組差異不顯著 （P＞0.05）。

2.3 成熟卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞是否部分脫除及對(duì)牛體外受精性控胚胎發(fā)育的影響

由表3可知，體外成熟培養(yǎng)24 h卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞脫除情況分為部分脫除組和不脫除組，當(dāng)卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞部分脫除時(shí)，經(jīng)性控冷凍精液體外受精后的體外受精卵裂率、囊胚率均顯著高于不脫除組的體外受精卵裂率、囊胚率（P＜0.05）。

3 討論

3.1 性控精子不同獲能方法對(duì)體外受精效果的影響

性控冷凍精液解凍后按照3種不同的方法進(jìn)行體外獲能，然后按常規(guī)程序進(jìn)行體外受精和體外培養(yǎng)。上浮獲能法體外受精卵裂率、囊胚率均顯著高于二次離心體外獲能法（P＜0.05）。一次離心體外獲能法體外受精卵裂率、囊胚率和精子上浮獲能法無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于二次離心體外獲能法（P＜0.05）。該結(jié)果與常規(guī)冷凍精液試驗(yàn)結(jié)果不同[6]。性控冷凍精子在X、Y精子分離過(guò)程中活力受到顯著降低，所以性控冷凍精液更適合采用精子上浮獲能法或一次離心體外獲能法，而普通精液的體外獲能方法更適合采用二次離心體外獲能法。

3.2 精子獲能液和體外受精液添加抗壞血酸對(duì)體外受精效果的影響

該試驗(yàn)結(jié)果表明，獲能液和體外受精液添加抗壞血酸組體外受精卵裂率、囊胚率顯著高于不添加組（P＜0.05）。性控冷凍精液在制備過(guò)程中，由于精子長(zhǎng)時(shí)間暴露于體外，外界環(huán)境因素刺激造成了精子氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS）[7]，死亡的精子釋放大量的ROS[8]，精子分選時(shí)除去富含抗氧化物質(zhì)的精漿，使得過(guò)多的ROS無(wú)法及時(shí)清除[9]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)在精液冷凍前稀釋液中添加一定量的白藜蘆醇等抗氧化劑，可降低羊[10]、牛[11]的精液冷凍過(guò)程中ROS對(duì)精子DNA的損傷，保護(hù)精子染色質(zhì)，降低精子冷凍保存誘導(dǎo)的氧化損傷[12]。這些氧化損傷會(huì)降低精子頂體反應(yīng)能力及卵母細(xì)胞融合能力，最終影響體外受精能力[13]。性控冷凍精液經(jīng)過(guò)染色和長(zhǎng)時(shí)間的體外分離及冷凍過(guò)程，精子體內(nèi)產(chǎn)生了較多的過(guò)氧化物，對(duì)于性控精子在進(jìn)行體外獲能、體外受精過(guò)程中通過(guò)添加抗氧化劑來(lái)降低氧化應(yīng)激水平，提高精子體外受精效果的研究并沒(méi)有人進(jìn)行試驗(yàn)。該試驗(yàn)證明了性控冷凍精液在體外獲能及體外受精液中添加抗氧化劑能夠降低由于氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS對(duì)活力較弱的性控精子的危害。

抗壞血酸具有親水性，可捕獲液相中游離的ROS，是精漿中可抵抗ROS對(duì)精子毒性的重要抗氧化物質(zhì)，可緩解氧應(yīng)激造成的損傷。有研究表明，將其作為抗氧化劑在精液冷凍保存中有著重要的應(yīng)用[14-16]。在精液稀釋液中添加抗壞血酸，能夠有效提高人、豬、牛精液的抗氧化性，降低DNA的氧化損傷，提高冷凍保存精子的運(yùn)動(dòng)性、膜完整性、頂體反應(yīng)能力，對(duì)于提高冷凍精液的受精能力有重要意義[17-19]。但對(duì)于將其作為體外性控胚胎生產(chǎn)過(guò)程中性控精子體外受精上的使用并未見報(bào)道。

3.3 體外受精前部分脫除卵丘細(xì)胞對(duì)體外性控胚胎發(fā)育的影響

在體外受精前，成熟卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞脫除情況為部分脫除組體外受精卵裂率顯著高于不脫除組（P＜0.05）。卵丘細(xì)胞在牛卵母細(xì)胞體外受精過(guò)程中有著許多重要作用，其中包括吸引、阻絆和選擇精子[15]，活力弱的精子在其阻絆下一般很難接近卵母細(xì)胞。在該試驗(yàn)中，COCs體外成熟培養(yǎng)之后采用性控精液直接進(jìn)行體外受精，其體外受精卵裂率顯著低于卵丘細(xì)胞部分脫除組（P＜0.05），這表明卵丘細(xì)胞顯著影響了性控精液對(duì)卵母細(xì)胞的受精能力。 Gao 等[20]、Khurana 等[21]研究都表明性控精液在體外受精過(guò)程中精子活力下降要顯著快于常規(guī)精液，因而卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞可能會(huì)阻擋活力不斷下降的性控精子與卵母細(xì)胞的受精，卵丘細(xì)胞部分脫除則可有效解決上述問(wèn)題，這也是解釋該試驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)原因。

4 結(jié)論

性控冷凍精子體外獲能采用一次離心體外獲能法或上浮獲能法精子獲能液和體外受精液宜添加抗壞血酸；成熟卵母細(xì)胞體外受精前部分脫除卵丘細(xì)胞，能夠提高性控精子體外受精率以達(dá)到體外高效生產(chǎn)牛體外性控胚胎的目的。