王根紅，張志忠

（合肥野生動(dòng)物園，安徽 合肥 230036）

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種人畜均可感染的腸道寄生蟲，主要傳播途徑為經(jīng)糞—口傳播[1]，能夠引起動(dòng)物及人以嚴(yán)重腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的隱孢子蟲病[2]。 隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis）是由1種或多種隱孢子蟲感染家畜、野生動(dòng)物、伴侶動(dòng)物及人類所引起的一種人畜共患原蟲病[3]。其主要危害免疫力低下的人和動(dòng)物，對(duì)幼齡動(dòng)物的危害較大。人和動(dòng)物感染后往往出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，甚至危及生命[4]，且目前尚未出現(xiàn)特效治療方法[5]。調(diào)查研究顯示，隱孢子蟲病能感染幼年動(dòng)物，臨床主要表現(xiàn)為消化道和呼吸道癥狀。而成年動(dòng)物感染隱孢子蟲病，多無臨床癥狀出現(xiàn)或表現(xiàn)為自限性腹瀉[6]。隱孢子蟲病呈全球性分布，在我國(guó)絕大多數(shù)省份均已報(bào)道過伴侶動(dòng)物、家畜及禽鳥類等可與人類密切接觸的動(dòng)物感染隱孢子蟲的實(shí)例，而關(guān)于野生動(dòng)物隱孢子蟲病的報(bào)道則極少[7-8]。隱孢子蟲蟲體是由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)的[8-9]，目前，研究者已在人畜體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的有效蟲種有30種，基因型有70余種[10-13]，但仍有些未得到確認(rèn)。其中，被認(rèn)定為人畜共患的隱孢子蟲包括微小隱孢子蟲（C.parvum）、人隱孢子蟲（C.hominis）、安氏隱孢子蟲（C.andersoni）、貝氏隱孢子蟲（C.baileyi）、貓隱孢子蟲（C.felis）、犬隱孢子蟲（C.canis）、小鼠隱孢子蟲（C.muris）、火雞隱孢子蟲（C.meleagridis）、牛隱孢子蟲（C.bovis）等。野生動(dòng)物也可感染隱孢子蟲病。在動(dòng)物園中人與野生動(dòng)物可以密切接觸，因此，對(duì)野生動(dòng)物隱孢子蟲感染的調(diào)查具有很重要的公共衛(wèi)生意義。

為了解合肥野生動(dòng)物園靈長(zhǎng)類野生動(dòng)物隱孢子蟲感染情況，該調(diào)查采用飽和蔗糖水漂浮法濃集卵囊，利用抗酸染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并采用PCR試驗(yàn)和瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣來源：于安徽省合肥市野生動(dòng)物園采集靈長(zhǎng)類動(dòng)物（動(dòng)物種類包括環(huán)尾狐猴、赤猴、狒狒、白額卷尾猴、綠猴和金絲猴）排泄的異常糞便。將新鮮糞便裝入無菌密封袋中，編號(hào)并記錄動(dòng)物的物種名稱，保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲教研室的4℃冰箱中。共采集糞樣24份。

1.1.2 主要試劑：0.4%NaOH溶液（4 g NaOH，1 000 mL蒸餾水）；飽和蔗糖水溶液；抗酸染液：抗酸Ⅰ液，抗酸Ⅱ液（濃硫酸10 mL，蒸餾水90 mL），抗酸Ⅲ液（孔雀藍(lán)2 g，蒸餾水100 mL）；DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；rTaq酶購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 飽和蔗糖水漂浮法：取適量動(dòng)物糞便樣本2 g，放入0.4%的氫氧化鈉溶液中洗滌（去除糖分）后，轉(zhuǎn)移至潔凈的燒杯中，加清水并用竹筷將其充分壓碎攪拌均勻，分別經(jīng)過60目和260目的篩子過篩，再加入適量清水稀釋，靜置1 h后，棄去上清液，保留沉淀。將上述沉淀均分轉(zhuǎn)移至2只離心管中，放入離心機(jī)3 000 r/min，離心10 min，注意在放入離心機(jī)之前用天平進(jìn)行配平。棄去上清液，用PBS緩沖液（pH值為7.2）洗滌3次。在離心管中加入沉淀體積5倍的飽和蔗糖水溶液，振蕩均勻，用天平進(jìn)行配平，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速800 r/min，離心8 min。用鐵絲圈蘸取表面液膜，輕輕地抖落至載玻片上，蓋好蓋玻片，鏡檢。

1.2.2 抗酸染色法：取離心沉淀后的糞便少許，在載玻片上涂成糞膜，干燥后進(jìn)行染色，滴加抗酸Ⅰ液數(shù)滴作用12 min，沖洗；滴加抗酸Ⅱ液作用5 min，沖洗，晾干；滴加抗酸Ⅲ液作用 1 min，沖洗，晾干后鏡檢。

根據(jù)鏡檢觀察到的蟲卵、卵囊或包囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小及其染色后顏色等特征，結(jié)合形態(tài)學(xué)相關(guān)的資料進(jìn)行蟲種鑒定。

1.2.3 利用PCR技術(shù)鑒定隱孢子蟲卵囊壁蛋白（COWP）基因：使用OMAGA糞便基因組提取試劑盒提取隱孢子蟲COWP基因，具體步驟參照說明書。 反應(yīng)體系如下：10×Buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；MgCl21.5 μL； 上、 下游引物各 1 μL；rTaq 酶 0.2 μL；DNA 8 μL；ddH2O 8.8 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s；47℃退火30 s；72℃延伸30 s；共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。采用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：采用SPSS 23.0軟件對(duì)24份待檢糞樣檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 飽和蔗糖水漂浮法檢查結(jié)果

對(duì)24份糞便樣本進(jìn)行漂浮法濃集后，在白額卷尾猴、赤猴、綠猴糞樣中未檢出隱孢子蟲卵囊。其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞樣均可以檢測(cè)出隱孢子蟲卵囊，其中環(huán)尾狐猴1份、狒狒2份、金絲猴1份。其形態(tài)均呈近圓形或橢圓形，在400倍顯微鏡下，隨機(jī)測(cè)量卵囊，其大小平均為 4.66 μm×5.18 μm（見圖 1）。

2.2 抗酸檢查結(jié)果

將糞便樣本中的蟲卵經(jīng)抗酸染色后，在油鏡下觀察，背景為藍(lán)綠色，卵囊呈玫瑰紅色且明顯折光，而囊壁不著色，外圈似有光暈圈，隱約可見內(nèi)部子孢子和顆粒殘?bào)w（見圖2）。根據(jù)卵囊染色后顏色、形態(tài)結(jié)構(gòu)及大小，可初步判定為隱孢子蟲蟲卵。

2.3 PCR的擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可發(fā)現(xiàn)目的條帶，大小為377 bp（見圖3），與預(yù)期結(jié)果相一致。

2.4 靈長(zhǎng)類隱孢子蟲感染率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采集的24份靈長(zhǎng)類動(dòng)物糞樣中共有4份樣品為隱孢子蟲陽性，感染動(dòng)物分別為環(huán)尾狐猴（25%）、狒狒（50%）、金絲猴（25%），總感染率為16.67%（見表1）；而白額卷尾猴、赤猴和綠猴糞便樣本中未檢出隱孢子蟲蟲卵。

3 討論

圖1 狒狒糞便樣本中的隱孢子蟲卵囊

圖2 抗酸染色后的隱孢子蟲卵囊（×1 000）

動(dòng)物園中的野生動(dòng)物能夠和人親密接觸，且隱孢子蟲病是可廣泛引起人和動(dòng)物腹瀉的人畜共患性疾病，極大地威脅了飼養(yǎng)員和游客的健康問題。據(jù)觀察，游客中低齡兒童和幼兒人數(shù)占了極大比重，而研究表明隱孢子蟲對(duì)免疫力低下的嬰幼兒感染率較高，危害較大，往往會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的腹瀉甚至危及生命。隱孢子蟲是一種機(jī)會(huì)性腸道病原體，也是艾滋病人最常見的繼發(fā)感染病原之一[4]。動(dòng)物隱孢子蟲病的防控方法主要是保持動(dòng)物生活環(huán)境的清潔，注意飲食、飲水的衛(wèi)生情況和有效處理糞便。該次調(diào)查在合肥野生動(dòng)物園靈長(zhǎng)類動(dòng)物的糞便中發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲蟲卵，證明靈長(zhǎng)類野生動(dòng)物確有隱孢子蟲感染，該項(xiàng)調(diào)查對(duì)公共衛(wèi)生具有較為重要的意義。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表1 靈長(zhǎng)類動(dòng)物隱孢子蟲感染情況

隱孢子蟲的傳染源為患病動(dòng)物及向外界排卵囊的人或動(dòng)物。卵囊可通過經(jīng)口直接感染方式、間接感染方式和通過飼料、飲水方式傳播，也可經(jīng)空氣傳播[9]。隱孢子蟲的宿主范圍非常廣，人、家畜、鳥類、爬行動(dòng)物以及野生動(dòng)物普遍易感。Muriuki等[11]運(yùn)用改良抗酸染色方法對(duì)肯尼亞地區(qū)包括51只黑毛猴和63只橄欖狒狒共114只非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行隱孢子蟲感染情況的檢測(cè)，結(jié)果顯示其陽性率高達(dá)51.7%。Lim等[13]對(duì)馬來西亞地區(qū)靈長(zhǎng)類動(dòng)物隱孢子蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，在99份糞便中共有14份呈隱孢子蟲陽性，其感染率約為14.1%。而該次采用PCR技術(shù)對(duì)合肥野生動(dòng)物園靈長(zhǎng)類動(dòng)物24份糞樣調(diào)查顯示，該園隱孢子蟲檢出率為16.67%，這與Lim等相關(guān)報(bào)道較為一致。

由此可見，動(dòng)物園存在靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染隱孢子蟲的情況，因此，對(duì)動(dòng)物園飼養(yǎng)的靈長(zhǎng)動(dòng)物進(jìn)行常規(guī)的隱孢子蟲感染情況監(jiān)測(cè)是必不可少的，有助于預(yù)防和控制隱孢子蟲病的傳播。