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        合肥野生動物園靈長類動物隱孢子蟲感染情況調查

        2018-07-31 07:41:26王根紅張志忠
        畜牧與飼料科學 2018年7期
        關鍵詞:糞樣蟲病靈長類

        王根紅,張志忠

        (合肥野生動物園,安徽 合肥 230036)

        隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種人畜均可感染的腸道寄生蟲,主要傳播途徑為經(jīng)糞—口傳播[1],能夠引起動物及人以嚴重腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的隱孢子蟲病[2]。 隱孢子蟲?。╟ryptosporidiosis)是由1種或多種隱孢子蟲感染家畜、野生動物、伴侶動物及人類所引起的一種人畜共患原蟲病[3]。其主要危害免疫力低下的人和動物,對幼齡動物的危害較大。人和動物感染后往往出現(xiàn)嚴重腹瀉,甚至危及生命[4],且目前尚未出現(xiàn)特效治療方法[5]。調查研究顯示,隱孢子蟲病能感染幼年動物,臨床主要表現(xiàn)為消化道和呼吸道癥狀。而成年動物感染隱孢子蟲病,多無臨床癥狀出現(xiàn)或表現(xiàn)為自限性腹瀉[6]。隱孢子蟲病呈全球性分布,在我國絕大多數(shù)省份均已報道過伴侶動物、家畜及禽鳥類等可與人類密切接觸的動物感染隱孢子蟲的實例,而關于野生動物隱孢子蟲病的報道則極少[7-8]。隱孢子蟲蟲體是由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺細胞中首次發(fā)現(xiàn)的[8-9],目前,研究者已在人畜體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的有效蟲種有30種,基因型有70余種[10-13],但仍有些未得到確認。其中,被認定為人畜共患的隱孢子蟲包括微小隱孢子蟲(C.parvum)、人隱孢子蟲(C.hominis)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)、貝氏隱孢子蟲(C.baileyi)、貓隱孢子蟲(C.felis)、犬隱孢子蟲(C.canis)、小鼠隱孢子蟲(C.muris)、火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)、牛隱孢子蟲(C.bovis)等。野生動物也可感染隱孢子蟲病。在動物園中人與野生動物可以密切接觸,因此,對野生動物隱孢子蟲感染的調查具有很重要的公共衛(wèi)生意義。

        為了解合肥野生動物園靈長類野生動物隱孢子蟲感染情況,該調查采用飽和蔗糖水漂浮法濃集卵囊,利用抗酸染色法進行形態(tài)學鑒定,并采用PCR試驗和瓊脂糖凝膠電泳試驗進行驗證。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 糞樣來源:于安徽省合肥市野生動物園采集靈長類動物(動物種類包括環(huán)尾狐猴、赤猴、狒狒、白額卷尾猴、綠猴和金絲猴)排泄的異常糞便。將新鮮糞便裝入無菌密封袋中,編號并記錄動物的物種名稱,保存于安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院寄生蟲教研室的4℃冰箱中。共采集糞樣24份。

        1.1.2 主要試劑:0.4%NaOH溶液(4 g NaOH,1 000 mL蒸餾水);飽和蔗糖水溶液;抗酸染液:抗酸Ⅰ液,抗酸Ⅱ液(濃硫酸10 mL,蒸餾水90 mL),抗酸Ⅲ液(孔雀藍2 g,蒸餾水100 mL);DNA提取試劑盒購自Omega公司;rTaq酶購自天根生化科技(北京)有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 飽和蔗糖水漂浮法:取適量動物糞便樣本2 g,放入0.4%的氫氧化鈉溶液中洗滌(去除糖分)后,轉移至潔凈的燒杯中,加清水并用竹筷將其充分壓碎攪拌均勻,分別經(jīng)過60目和260目的篩子過篩,再加入適量清水稀釋,靜置1 h后,棄去上清液,保留沉淀。將上述沉淀均分轉移至2只離心管中,放入離心機3 000 r/min,離心10 min,注意在放入離心機之前用天平進行配平。棄去上清液,用PBS緩沖液(pH值為7.2)洗滌3次。在離心管中加入沉淀體積5倍的飽和蔗糖水溶液,振蕩均勻,用天平進行配平,放入離心機中,轉速800 r/min,離心8 min。用鐵絲圈蘸取表面液膜,輕輕地抖落至載玻片上,蓋好蓋玻片,鏡檢。

        1.2.2 抗酸染色法:取離心沉淀后的糞便少許,在載玻片上涂成糞膜,干燥后進行染色,滴加抗酸Ⅰ液數(shù)滴作用12 min,沖洗;滴加抗酸Ⅱ液作用5 min,沖洗,晾干;滴加抗酸Ⅲ液作用 1 min,沖洗,晾干后鏡檢。

        根據(jù)鏡檢觀察到的蟲卵、卵囊或包囊的形態(tài)結構、大小及其染色后顏色等特征,結合形態(tài)學相關的資料進行蟲種鑒定。

        1.2.3 利用PCR技術鑒定隱孢子蟲卵囊壁蛋白(COWP)基因:使用OMAGA糞便基因組提取試劑盒提取隱孢子蟲COWP基因,具體步驟參照說明書。 反應體系如下:10×Buffer 2.5 μL;dNTP 2 μL;MgCl21.5 μL; 上、 下游引物各 1 μL;rTaq 酶 0.2 μL;DNA 8 μL;ddH2O 8.8 μL。 反應條件:95 ℃預變性5 min;95℃變性45 s;47℃退火30 s;72℃延伸30 s;共35個循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。采用1%瓊脂糖進行電泳,檢測PCR擴增產(chǎn)物。

        1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計:采用SPSS 23.0軟件對24份待檢糞樣檢測結果進行統(tǒng)計分析。

        2 結果

        2.1 飽和蔗糖水漂浮法檢查結果

        對24份糞便樣本進行漂浮法濃集后,在白額卷尾猴、赤猴、綠猴糞樣中未檢出隱孢子蟲卵囊。其他靈長類動物糞樣均可以檢測出隱孢子蟲卵囊,其中環(huán)尾狐猴1份、狒狒2份、金絲猴1份。其形態(tài)均呈近圓形或橢圓形,在400倍顯微鏡下,隨機測量卵囊,其大小平均為 4.66 μm×5.18 μm(見圖 1)。

        2.2 抗酸檢查結果

        將糞便樣本中的蟲卵經(jīng)抗酸染色后,在油鏡下觀察,背景為藍綠色,卵囊呈玫瑰紅色且明顯折光,而囊壁不著色,外圈似有光暈圈,隱約可見內(nèi)部子孢子和顆粒殘體(見圖2)。根據(jù)卵囊染色后顏色、形態(tài)結構及大小,可初步判定為隱孢子蟲蟲卵。

        2.3 PCR的擴增結果

        經(jīng)PCR擴增后,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定可發(fā)現(xiàn)目的條帶,大小為377 bp(見圖3),與預期結果相一致。

        2.4 靈長類隱孢子蟲感染率統(tǒng)計結果

        采集的24份靈長類動物糞樣中共有4份樣品為隱孢子蟲陽性,感染動物分別為環(huán)尾狐猴(25%)、狒狒(50%)、金絲猴(25%),總感染率為16.67%(見表1);而白額卷尾猴、赤猴和綠猴糞便樣本中未檢出隱孢子蟲蟲卵。

        3 討論

        圖1 狒狒糞便樣本中的隱孢子蟲卵囊

        圖2 抗酸染色后的隱孢子蟲卵囊(×1 000)

        動物園中的野生動物能夠和人親密接觸,且隱孢子蟲病是可廣泛引起人和動物腹瀉的人畜共患性疾病,極大地威脅了飼養(yǎng)員和游客的健康問題。據(jù)觀察,游客中低齡兒童和幼兒人數(shù)占了極大比重,而研究表明隱孢子蟲對免疫力低下的嬰幼兒感染率較高,危害較大,往往會導致更嚴重的腹瀉甚至危及生命。隱孢子蟲是一種機會性腸道病原體,也是艾滋病人最常見的繼發(fā)感染病原之一[4]。動物隱孢子蟲病的防控方法主要是保持動物生活環(huán)境的清潔,注意飲食、飲水的衛(wèi)生情況和有效處理糞便。該次調查在合肥野生動物園靈長類動物的糞便中發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲蟲卵,證明靈長類野生動物確有隱孢子蟲感染,該項調查對公共衛(wèi)生具有較為重要的意義。

        圖3 PCR擴增產(chǎn)物

        表1 靈長類動物隱孢子蟲感染情況

        隱孢子蟲的傳染源為患病動物及向外界排卵囊的人或動物。卵囊可通過經(jīng)口直接感染方式、間接感染方式和通過飼料、飲水方式傳播,也可經(jīng)空氣傳播[9]。隱孢子蟲的宿主范圍非常廣,人、家畜、鳥類、爬行動物以及野生動物普遍易感。Muriuki等[11]運用改良抗酸染色方法對肯尼亞地區(qū)包括51只黑毛猴和63只橄欖狒狒共114只非人類靈長類動物進行隱孢子蟲感染情況的檢測,結果顯示其陽性率高達51.7%。Lim等[13]對馬來西亞地區(qū)靈長類動物隱孢子蟲感染情況進行了調查,在99份糞便中共有14份呈隱孢子蟲陽性,其感染率約為14.1%。而該次采用PCR技術對合肥野生動物園靈長類動物24份糞樣調查顯示,該園隱孢子蟲檢出率為16.67%,這與Lim等相關報道較為一致。

        由此可見,動物園存在靈長類動物感染隱孢子蟲的情況,因此,對動物園飼養(yǎng)的靈長動物進行常規(guī)的隱孢子蟲感染情況監(jiān)測是必不可少的,有助于預防和控制隱孢子蟲病的傳播。

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