鐘 瑩,王占科,周方強(qiáng),胡 添,王慶蒞,郭 靚

多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是指在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染和休克后，傷前無器官功能不全患者同時或相繼出現(xiàn)2個或2個以上器官功能不全的綜合征[1-2]。嚴(yán)重?zé)?燙)傷作為嚴(yán)重的創(chuàng)傷，并發(fā)MODS涉及全身性感染炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及糖代謝紊亂導(dǎo)致的高血糖和高乳酸血癥，晚期病死率高，是住院燒傷患者死亡的主要原因，早期發(fā)現(xiàn)和綜合干預(yù)創(chuàng)傷后MODS是降低住院患者病死率的有效手段[3-6]。文獻(xiàn)報道，胰島素和丙酮酸乙酯均具有抗炎和抗氧化作用,且聯(lián)合治療較單獨(dú)治療效果好[7]。極化液主要成分為胰島素、葡萄糖和氯化鉀，是心血管內(nèi)科一種傳統(tǒng)藥物[8]。極化液和胰島素不完全相同，丙酮酸鈉和丙酮酸乙酯也有根本不同的性質(zhì)，二者聯(lián)合治療嚴(yán)重創(chuàng)傷MODS實(shí)驗(yàn)研究報道較少。本研究探討極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療嚴(yán)重創(chuàng)傷MODS作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及材料 清潔級健康成年SD大鼠，體重(200±15)g，雌雄各半[江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2016-0001，質(zhì)量合格證號1308116]；胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：3.0 ml：300 U)；丙酮酸鈉(美國sigma公司，分析純)；內(nèi)毒素[Lipopolysaccharide(LPS), E.coli O111:B4，美國sigma公司,分析純]。血可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)蛋白1(sTREM-1)和高遷移率族蛋白B1(HMGB-l)等炎性因子和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒均由美國Sigma公司生產(chǎn)。MDA化學(xué)比色法檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒均購自福建新大陸生物技術(shù)股份有限公司。血糖(GLU)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血肌酐(CRE)和血肌酸激酶(CK)生化檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2儀器 TDZ4B-WS型離心機(jī)從湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司購買；HH-W21型電熱恒溫水浴箱從上海醫(yī)用恒溫設(shè)備有限公司購買；JB-1型全自動快速立式洗板機(jī)從鄭州基波新科技有限公司購買；BIO-RAD550型酶標(biāo)儀購自美國伯樂BIO-RAD公司；BS2000型全自動生化分析儀由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)。

1.3動物模型制作和分組 80只清潔級健康成年SD大鼠無菌包裝條件下，運(yùn)輸?shù)浇夥跑?4醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室[實(shí)驗(yàn)室許可證SYXK(贛)2013-001]清潔級大鼠實(shí)驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，燙傷前1 d進(jìn)行尾靜脈采血，然后根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行麻醉后背部剪毛，浸入(92.0±2.0)℃水中20 s，制作30%體表面積(TBSA)Ⅲ度燙傷，傷后2 h按5 mg/kg體重腹腔注射內(nèi)毒素(1.0 mg/ml,5.0 ml/kg)，同時腹腔注射生理鹽水3.0 ml抗休克。燙傷大鼠傷后1 d并發(fā)肝功能、腎功能和心肌酶等指標(biāo)明顯高于傷前，并持續(xù)到傷后7 d，為創(chuàng)傷MODS模型制作成功。將制備后的嚴(yán)重燙傷內(nèi)毒素血癥MODS動物模型，按隨機(jī)數(shù)字表法分為極化液治療組(GIK組)、丙酮酸鈉治療組(SP組)、極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組(GIK+SP組)及對照組,每組20只。

1.4給藥劑量和途徑 GIK組：參考文獻(xiàn)[9]配制葡萄糖、胰島素和氯化鉀終濃度分別為100 g/L、80 U/L和5 g/L極化液治療溶液，胰島素和葡萄糖治療劑量分別為5.6 U/(kg·d)和7.0 g/(kg·d),傷后6 h,腹腔注射1次，然后每8小時腹腔注射1次,連續(xù)7 d。SP組：用生理鹽水配制丙酮酸鈉終濃度為0.25 g/L的丙酮酸治療液，按12.5 mg/(kg·d)治療劑量，傷后6 h腹腔注射1次，然后每8小時腹腔注射1次,連續(xù)7 d。GIK+SP組：極化液和丙酮酸鈉治療劑量和治療時間分別同GIK組和SP組，先腹腔注射丙酮酸鈉溶液，隨后注射極化液溶液。對照組：只注射生理鹽水，其他同GIK組。各組大鼠雌雄比，傷前體重，喂食和飲水條件相同，腹腔注射溶液總體積相同，均為3 ml。丙酮酸鈉溶液需臨時配制，放冰箱4℃保存，配制后當(dāng)天內(nèi)使用。

1.5樣品采集及測定指標(biāo) 各組燙傷大鼠，參考文獻(xiàn)[10]分別于傷前，傷后1、3、5和7 d進(jìn)行尾靜脈采血，采血前禁食8 h但可以自由飲水，肝素鈉抗凝，離心后，分離血漿，-80℃超低溫液氮罐內(nèi)保存。標(biāo)本相關(guān)指標(biāo)檢測時，各組血液標(biāo)本統(tǒng)一凍融，嚴(yán)格按照各指標(biāo)檢測試劑盒說明書測定。空腹GLU、LA、ALT、CRE和CK及SOD測定采用酶法，血漿MDA測定采用化學(xué)終點(diǎn)比色法在全自動生化分析儀上進(jìn)行測定。血漿sTREM-1和HMGB1采用ELISA檢測法在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定。所有指標(biāo)質(zhì)控均在控，標(biāo)本檢測濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1大鼠存活情況 對照組大鼠傷后7 d存活14只，存活率為70%；SP組和GIK組傷后7 d均存活16只，存活率均為80%，GIK+SP組傷后7 d存活17只，存活率為85%。4組傷后7 d大鼠存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠傷后不同時間存活情況(只)

注：GIK組為極化液對照組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK組+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水

2.2大鼠GLU和主要臟器功能指標(biāo)情況 4組傷后各時點(diǎn)GLU、ALT、CK和CRE高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK組、SP組和GIK+SP組傷后各時點(diǎn)ALT、CK和CRE均低于對照組，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK+SP組和GIK組傷后各時點(diǎn)GLU低于SP組和對照組(P<0.01)，GIK+SP組和GIK組GLU比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組嚴(yán)重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠GLU、ALT、CRE和CK水平變化

注：GLU為血糖，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，CRE為血肌酐，CK為血肌酸激酶；GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01;與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

2.3血乳酸、丙酮酸水平變化 4組傷后各時點(diǎn)血LA、PA和LA/PA均高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK+SP組、GIK組、SP組傷后各時點(diǎn)血LA和LA/PA水平均低于對照組，且GIK+SP組傷后各時點(diǎn)LA和LA/PA水平低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK+SP、GIK、SP組傷后各時點(diǎn)血PA高于對照組(P<0.01)，但GIK+SP、GIK、SP組血PA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4大鼠血漿sTREM-1和HMGB1水平變化 4組傷后各時點(diǎn)血漿sTREM-1和HMGB1水平均高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點(diǎn)血漿sTREM-1和HMGB1水平均低于對照組(P<0.01)，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)。見表4。

2.5大鼠血漿MDA和SOD水平變化 4組傷后各時相點(diǎn)血漿MDA含量高于傷前，SOD低于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點(diǎn)血漿MDA含量均低于對照組，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點(diǎn)血漿SOD水平均高于治療對照組，且GIK+SP組高于GIK組和SP組(P<0.01)。見表5。

表3 4組嚴(yán)重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血LA、PA和LA/PA水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；LA為乳酸，PA為丙酮酸；與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

表4 4組嚴(yán)重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血漿sTREM-1和HMGB1水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組；sTREM-1為血可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)蛋白1，HMGB-l為高遷移率族蛋白B1;與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

表5 4組嚴(yán)重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血漿MDA和SOD水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶;與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

3 討論

極化液基本成分為葡萄糖、胰島素和氯化鉀，不同成分發(fā)揮不同作用，葡萄糖為機(jī)體提供營養(yǎng)和能量，胰島素刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)的細(xì)胞內(nèi)移位和活性，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活力，促進(jìn)葡萄糖的有效轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝利用。葡萄糖和胰島素都能刺激細(xì)胞膜上鈉-鉀泵(Na+-K+-ATPase)活性，在促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)同時也增進(jìn)鉀離子由細(xì)胞外泵向細(xì)胞內(nèi)，降低血鉀濃度，因此，輸注葡萄糖同時輸注氯化鉀可避免輸注葡萄糖引起的低鉀血癥[11-12]。

文獻(xiàn)報道，胰島素不僅用于控制糖尿病患者高血糖，還可用于外科手術(shù)后及嚴(yán)重感染炎癥危重病患者高血糖控制，抗氧化與抗炎癥效果良好[13-18]。嚴(yán)重創(chuàng)傷患者血糖水平不一定升高，極化液不僅用于嚴(yán)重創(chuàng)傷高血糖患者，也可用于嚴(yán)重創(chuàng)傷正常血糖患者，其作為葡萄糖和胰島素聯(lián)合制劑較單純胰島素治療更具有廣泛的適應(yīng)證。極化液在創(chuàng)傷患者應(yīng)用過程中，應(yīng)密切觀察血鉀和血糖水平，及時調(diào)整葡萄糖和氯化鉀用量[9]。

嚴(yán)重創(chuàng)傷后并發(fā)高血糖、高乳酸血癥及LA/PA比值升高，加劇MODS發(fā)生與發(fā)展，高乳酸血癥可作為評估嚴(yán)重創(chuàng)傷、敗血癥和休克等危重病預(yù)后的重要指標(biāo)[19-20]。本研究結(jié)果表明，極化液治療可降低嚴(yán)重創(chuàng)傷內(nèi)毒素血癥MODS大鼠空腹GLU、LA和LA/PA比值等糖代謝障礙指標(biāo)和氧化還原勢能減低的相關(guān)指標(biāo)，提示極化液治療不僅能改善糖代謝障礙還能夠控制高乳酸血癥。血sTREM-1是細(xì)胞膜TREM-1游離的可溶性片段，可作為創(chuàng)傷患者早期感染標(biāo)記物，膜TREM-1屬于內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)受體蛋白，內(nèi)毒素與膜TREM-1啟動機(jī)體炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)機(jī)體腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等多種炎性細(xì)胞因子升高。HMGB-1是一種晚期升高敏感的感染炎性細(xì)胞因子，嚴(yán)重創(chuàng)傷感染者血HMGB-1升高[21-22]。本研究結(jié)果顯示，極化液治療可降低嚴(yán)重創(chuàng)傷內(nèi)毒素血癥MODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平，提示極化液有良好抗炎作用。血MDA升高伴隨SOD活力下降是評估機(jī)體氧化應(yīng)激程度的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果顯示，極化液可降低嚴(yán)重?zé)齻鸐ODS大鼠血MDA水平，提高SOD活力，提示極化液也有抗氧化作用。極化液抗氧化機(jī)制可能與胰島素直接抗炎和降低高血糖及糾正糖代謝障礙和改善機(jī)體營養(yǎng)有關(guān)。

PA是體內(nèi)天然小分子物質(zhì)，是葡萄糖代謝中間產(chǎn)物，也是葡萄糖代謝生成大量ATP三羧酸循環(huán)原料乙酰輔酶A的前提物質(zhì)，內(nèi)源性PA參與全身各組織和器官細(xì)胞三大物質(zhì)能量代謝。丙酮酸鈉易溶于水，在體內(nèi)通過結(jié)合氧和氮自由基，直接發(fā)揮強(qiáng)有力的抗氧化作用，也可通過提高細(xì)胞內(nèi)氧化還原勢能，間接發(fā)揮抗氧化功能[24-25]。近年文獻(xiàn)報道，丙酮酸鹽無論經(jīng)靜脈、腹腔或口服途徑，在致死性休克復(fù)蘇中能提高細(xì)胞的缺氧耐受性，都有顯著的多器官保護(hù)和糾正糖代謝紊亂的作用，并有效逆轉(zhuǎn)缺氧型乳酸性酸中毒，成倍提高實(shí)驗(yàn)動物生存率[26-27]。

本研究結(jié)果顯示，丙酮酸鈉治療可明顯降低嚴(yán)重?zé)齻鸐ODS大鼠血LA和LA/PA比值等指標(biāo)，提示丙酮酸鈉具有控制高乳酸血癥的功能。本研究結(jié)果還表明，丙酮酸鈉和GIK治療均明顯提高血PA濃度，說明丙酮酸鈉降低LA/PA比值主要與降低LA水平和提高PA水平有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸鈉治療可顯著降低嚴(yán)重?zé)齻鸐ODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平,也可以顯著降低MDA水平和提高血SOD活力，進(jìn)一步說明丙酮酸鈉和極化液一樣具有有力的拮抗嚴(yán)重創(chuàng)傷MODS過度炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激效果。丙酮酸鈉和極化液也具有類似的抑制高乳酸血癥作用,但因未觀察酸中毒指標(biāo)，丙酮酸鈉是否對糾正危重的乳酸性酸中毒，或合并治療有更好的效果,尚有待觀察。需要指出的是本文所用丙酮酸鈉治療劑量為12.5 mg/(kg·d),屬于超小劑量治療，盡管結(jié)果顯示其具有控制高乳酸血癥和有力的抗氧化與抗炎作用，但不能完全糾正高乳酸血癥和逆轉(zhuǎn)LA/PA比值，可能與使用劑量小有關(guān)。丙酮酸鈉不同治療劑量療效評估值得進(jìn)一步研究。

雖然丙酮酸乙酯也具有抗炎和抗氧化作用[24]，但丙酮酸鈉和丙酮酸乙酯有本質(zhì)不同， 丙酮酸鈉是鹽類，在體內(nèi)天然存在，而丙酮酸乙酯是酯類，并不存在于體內(nèi)。盡管二者都能糾正高乳酸血癥，并具備抗氧化和抗炎作用，但丙酮酸乙酯并不同時具備糾正代謝性酸中毒的作用，水溶液并不穩(wěn)定,二期臨床試驗(yàn)已經(jīng)失敗[28]。丙酮酸鈉的實(shí)驗(yàn)和臨床研究國內(nèi)外已有多項(xiàng)報道，其大劑量輸注顯示安全無毒性[29]。糾正高乳酸血癥、控制炎癥和氧化應(yīng)激是治療危重病患者的重要措施，臨床需求迫切性值得深入探討丙酮酸鹽的潛在作用，丙酮酸鈉相對丙酮酸乙酯更具有臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)前景。

綜上所述，嚴(yán)重創(chuàng)傷MODS患者往往需要綜合治療，極化液和丙酮酸鈉均作為人體內(nèi)天然存在的成分，二者聯(lián)合治療效果值得研究。胰島素、葡萄糖和丙酮酸鈉在糾正高乳酸血癥、抗炎和抗氧化方面，可能存在協(xié)同促進(jìn)作用，胰島素不僅促進(jìn)葡萄糖生成丙酮酸，并進(jìn)一步促進(jìn)丙酮酸代謝和三羧酸循環(huán)生成大量ATP，深入的作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討。