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肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，MP流行具有周期性，每3-7年在不同地區(qū)出現(xiàn)發(fā)病率高峰，每次流行持續(xù)1-2年。2010年11月，丹麥學者通過其實驗室監(jiān)測判斷2010年冬季至2011年春季Mp感染在丹麥呈暴發(fā)流行趨勢[1]，其后在歐洲和亞洲許多國家都監(jiān)測到MP暴發(fā)流行[2]。近年來，北京地區(qū)監(jiān)測到北京地區(qū)MP感染率也有所增高，2007年及2012年出現(xiàn)暴發(fā)流行[3]。無錫地區(qū)兒童肺炎支原體感染感染率相對較高[8]，但目前針對無錫地區(qū)兒童肺炎支原體基因分型及大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢測相關的報道較少。本研究對2015-2016年無錫地區(qū)呼吸道感染中肺炎支原體的感染率、基因分子特征等進行綜合分析，了解無錫地區(qū)MP流行特點。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取本院呼吸科收治呼吸道感染患兒1 129例，標本類型為咽拭子。肺炎支原體參考菌株：本研究所用肺炎支原體陽性參考菌株為首都兒科研究所細菌研究室保存國際標準株FH(ATCCl5531)。

1.2肺炎支原體檢測 采用TIANcombi DNALyse&Amp PCR Kit試劑盒對上述呼吸道標本進行DNA提取，操作步驟參照說明書分布進行。Real-time PCR法對其進行檢測，引物及探針參照Dumke[4]等研究方法。

1.3P1-RELP基因分型 Real-time PCR法檢測的陽性標本采用PCR-RFLP分析方法進行分型[5]。

1.4MLVA基因分型 MLVA分型參照Derange等研究方法，引物參考文獻[6]。采用巢式PCR對肺炎支原體基因組中的5個VNTR位點(Mpnl、Mpnl3、Mpnl4、Mpnl5及Mpnl6)進行擴增，擴增產(chǎn)物測序，分析測序結(jié)果，根據(jù)這5個VNTR中重復片段數(shù)目的組合不同，將其進行MLVA分型。

1.5大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關基因突變檢測 針對肺炎支原體23S rRNA，采用首都兒科研究所細菌研究室nPCR法擴增包含位點2063，2064，2067，2611及2617的片段，引物序列見參考文獻[7]。擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blast比對，分析點突變情況。

1.6數(shù)據(jù)分析 應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用方差分析、計數(shù)資料采用卡方檢驗，檢驗結(jié)果P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1肺炎支原體感染陽性檢出率 2015—2016年，共收集患兒呼吸道咽拭子標本1 129例，通過real-time PCR檢測出陽性標本98例，總陽性率為8.68%。其中男性48例，女性50例，患兒平均年齡(4.55±2.44)歲，分為≤2歲，2～5歲，5～10歲和>10歲4組，具體分布見表1 ，陽性標本在性別、年齡上分布上差異沒有統(tǒng)計學意義(F=2.26，P=0.52)。

根據(jù)采集標本的時間不同，2015年、2016年分別是44例(44/545)、54例(54/584)，陽性感染率分別為8.07%、9.25%。2015年6-8月份共18例占陽性標本總數(shù)的40.9%，分別為15.2%(5/33)，11.4%(4/35)，21.9%(9/41)；2016年6-9月份共23例占總陽性標本總數(shù)的42.5%，分別為15.4%(8/52)，16.9%(10/59)，19.2%(5/26)，8%(4/50)。

表1 MP陽性標本性別、年齡分布
Tab.1 Distribution of MP positive specimens in sex and age

年齡組性別統(tǒng)計量男女χ2P值≤2982～516242.260.525～102217>1011

2.2P1基因分型 通過對P1基因的檢測，34例成功進行了P1分型，其中P1-1型25例(73.5%)，P1-2型9例(26.5%)。根據(jù)采樣年份不同，2015年P1-1型占總數(shù)的80.95%，2016年P1-1型占總數(shù)的61.54%。圖1可見，P1-1型中M3-5-5-2、M4-5-6-2型各1例，M4-5-7-2型23例；P1-2型中M3-5-6-2型8例，M3-6-6-2型1例。

圖1 MLVA基因分型在P1亞型中的分布Fig.1 Distribution of MLVA genotyping in P1 subtypes

按照P1基因分型將34例樣本分為兩組并進行臨床資料分析，結(jié)果顯示P1-1基因型MP感染患兒在住院天數(shù)上大于P1-2基因型MP感染患兒，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(F=4.67，P=0.04)。而發(fā)熱持續(xù)時間、白細胞總數(shù)、C反應蛋白和血沉等指標兩個基因型間的差別無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表2。

2.3MLVA基因分型 對98例陽性標本進行5個VNTR位點的MLVA基因分型，其中40例標本可以分為12個不同的基因型，其中主要的基因型為M4-4-5-7-2(32.5%)和M3-4-5-7-2(17.5%)。本次研究中，采用改良方法只分析4個VNTR位點，可將44例標本有效地分為5個基因型，分別為M3-5-5-2(1/44)，M3-5-6-2(8/44)，M3-6-6-2(1/44)，M4-5-6-2(1/44)及M4-5-7-2(33/44)，其中主要的基因型為M4-5-7-2(75%)和M3-5-6-2(18.2%)。

由于M3-5-5-2、M3-6-6-2、M4-5-6-2型例數(shù)較少，僅比較M3-5-6-2和M4-5-7-2型MP感染患兒的臨床表現(xiàn)。M4-5-7-2型患兒發(fā)熱天數(shù)和總住院天數(shù)較M3-5-6-2型多，兩組差異沒有統(tǒng)計學意義。兩組在白細胞計數(shù)、C反應蛋白、血沉等實驗室檢查方面差異均無統(tǒng)計學差異，結(jié)果表3。

表2 不同P1基因型MP患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.2 Clinical manifestations of children in different P1 genotype

臨床指標P1基因型統(tǒng)計量P1-1P1-2F值P值發(fā)熱持續(xù)時間(d)4.44±3.143.11±2.851.240.27白細胞總數(shù)(109/L)7.95±2.618.65±3.200.420.52C反應蛋白(g/L)8.00±8.5914.00±17.771.700.20血沉(mm/h)25.46±18.6429.22±14.330.300.59住院天數(shù)(d)8.91±2.137.33±0.714.670.04

圖2 兩種MLVA基因分型分類統(tǒng)計對比圖Fig.2 Comparison diagram of different types of MLVA genotyping

2.4耐藥基因分析 對98例陽性標本進行大環(huán)內(nèi)酯類耐藥位點的基因檢測，其中44例完成了23S rRNA基因區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的檢測，28例為A2063G點突變，1例為A2063T點突變，耐藥基因總突變率為65.9%，其余15例未發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變。44例標本中，33例完成了基因分型檢測，其中23例發(fā)生耐藥基因突變的標本中21例MLVA分型為M4-5-7-2，1例為M4-5-6-2，1例為M3-5-5-2；9例未發(fā)生耐藥基因突變標本中8例為M3-5-6-2基因型，1例為M3-6-6-2。

表3 不同MLVA基因型MP患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.3 Comparison of children’s clinical manifestations in different MLVA genotypes

臨床指標MLVA型別統(tǒng)計量M3-5-6-2M4-5-7-2F值P值發(fā)熱持續(xù)時間(d)3.00±3.023.61±3.090.250.62白細胞總數(shù)(109/L)8.64±3.428.15±2.550.200.65C反應蛋白(g/L)14.14±18.988.86±9.621.280.26血沉(mm/h)29.75±15.2326.52±17.530.230.64住院天數(shù)(d)7.38±0.748.63±1.933.180.08

圖3 MLVA基因分型在耐藥基因亞型中的分布Fig.3 Distribution of MLVA genotyping in drug-resistant subtypes

臨床資料分析顯示，23S rRNA基因區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因為突變，即敏感組在發(fā)熱持續(xù)時間、大環(huán)內(nèi)酯類藥物用時、白細胞總數(shù)、住院天數(shù)等指標上小于耐藥組即A2063G/T點突變，但兩組差異無統(tǒng)計學意義。敏感組C反應蛋白和血沉兩個指標高于耐藥組，但兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果詳見表4。

表4 MP肺炎耐藥基因敏感/耐藥組患兒臨床表現(xiàn)比較
Tab.4 Different clinical manifestations in resistant gene sensitive/resistant group

臨床指標耐藥基因統(tǒng)計量A2063G/TSF值P值發(fā)熱持續(xù)時間(d)4.07±3.122.80±2.511.240.27大環(huán)內(nèi)酯類用時(d)3.11±3.52.33±2.790.550.47白細胞總數(shù)(109/L)8.19±2.328.05±2.910.030.87C反應蛋白(g/L)6.89±7.1812.62±14.722.960.09血沉(mm/h)24.18±16.2927.67±14.850.480.49住院天數(shù)(d)8.70±2.018.00±1.251.500.23

3 討 論

肺炎支原體(MP)是引起兒童急性上、下呼吸道感染疾病常見的病原微生物。MP感染具有流行性，呈遞增趨勢其感染率約占肺炎的10%～20%。目前MP致炎機制尚不完全清楚，但國內(nèi)外針對MP基因組學研究表明MP基因型別鑒定有利于其感染流行趨勢的預測。本研究采用Real-time PCR法對呼吸道感染患兒進行MP相關基因檢測，并分析了無錫地區(qū)MP感染情況及分子流行特點。

通過對無錫地區(qū)1 129例呼吸道感染患兒的咽拭子標本進行MP-DNA檢測，結(jié)果顯示陽性標本98例，陽性率為8.68%，夏季好發(fā)，發(fā)病平均年齡在4～5歲，且2016年MP陽性率(9.25%)較2015年(8.07%)上升，此趨勢與薛冠華等報道的北京地區(qū)2015—2016年MP流行趨勢一致[8]。近幾年陸續(xù)有文獻報道國內(nèi)各地區(qū)MP感染陽性率，2011年大慶市[9]兒童MP檢測陽性率達到48.18%，2011在天津相關研究顯示[10]社區(qū)獲得性肺炎的MP陽性率為41.8%，而孫紅妹等[11]人的數(shù)據(jù)顯示2010年北京地區(qū)MP感染率11.69%，2011年有所增加為15.56%。本次研究中MP陽性率低于其他地區(qū)報道，一方面顯示的是MP感染的地域差異，另一方面研究中直接取樣呼吸道感染患兒的咽拭子標本，其DNA含量較其他研究中痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液等生物樣本要低，考慮檢出率低可能與DNA模板濃度低有關。

P1基因編碼的P1蛋白是MP的主要黏附素及毒力因子，也是MP黏附于呼吸道細胞表面的第一步[12]。根據(jù)不同菌株P1基因上RepMP重復序列的多態(tài)性，采用PCR-RFLP方法建立了P1基因的分型體系，可分為M129為代表的P1-1和以FH為代表的P1-2兩型。隨后研究者在日本、法國、丹麥、德國等地區(qū)發(fā)現(xiàn)MP流行周期內(nèi)均有MP P1-1和P1-2基因型別的轉(zhuǎn)換。國內(nèi)徐巧等人對西安地區(qū)還有天津地區(qū)[10]基因分型未發(fā)現(xiàn)P1-2型菌株。2010年1月至2012年5月北京地區(qū)[11]發(fā)現(xiàn)2例P1-2型(占2.90%)，蘇州大學附屬兒童醫(yī)院的研究[13]顯示2012-2013年期間蘇州地區(qū)發(fā)生的MP感染P1-2占總樣本數(shù)的2.88%。本次中34例標本完成P1基因的成功分型，其中P1-1占73.5%，P1-2占26.5%，P1-2型菌株所占比例高于國內(nèi)其他區(qū)域，其中2015年19.05%，2016年38.46%，有增長趨勢。有研究表明[14]日本地區(qū)8-10年發(fā)生型別轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，而型別轉(zhuǎn)換時間需要2-3年，結(jié)合本次研究，無錫地區(qū)MP感染可能出現(xiàn) P1-1型向P1-2型的型別轉(zhuǎn)換，進而出現(xiàn)新的流行亞型。

多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)，是一種基于染色體基因組中基因座上的短鏈重復區(qū)拷貝數(shù)的不同進行基因多態(tài)性檢測的方法，2009年S.Degrange等首次將這種方法應用于MP基因分型研究，選擇了5個TRs區(qū)域：Mpn1，Mpn13，Mpn14，Mpn15，Mpn16，將MP分為26個型別[15]。隨后有學者發(fā)現(xiàn)Mpn1存在不穩(wěn)定性，提出采用剩余的4個位點Mpn13，Mpn14，Mpn15及Mpn16可以快速、簡單地檢測臨床標本MP基因型[16-17]。本次研究中，成功分型40例臨床樣本，共分為12個不同基因型，其中M4-4-5-7-2和M3-4-5-7-2兩個基因型占總樣本數(shù)的50.0%。采用改良的4位點MLVA分型法成功分型44例臨床樣本，分別為M3-5-5-2(1/44)，M3-5-6-2(8/44)，M3-6-6-2(1/44)，M4-5-6-2(1/44)及M4-5-7-2(33/44)，改良MLVA分型可將MP菌株進行更為優(yōu)化的分型。結(jié)合臨床資料分析結(jié)果顯示MLVA分型與文中所研究中患兒臨床特點之間并未出現(xiàn)統(tǒng)計學上的差異。因此尋求更優(yōu)的基因分型仍是分析亞型的重要研究方向，這樣才能建立與臨床特征聯(lián)系，才能更好的指導臨床和流行病學監(jiān)控。

隨著研究不斷深入，MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機制主要表現(xiàn)為基因突變，其中23S rRNA基因V區(qū)A2063G、A2064G、A2067G點突變分別與14、15、16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥相關。美國及西歐國家 MP耐藥率則普遍低于10.0%，但有增高的趨勢[18]。2002-2008年日本MP耐藥率從5.0%上升到>40.0%，2011年則高達 80.0%[19]。在亞洲多個國家Mp的耐藥率甚至超過了90%，首都兒科研究所對2009—2013年北京地區(qū)的肺炎支原體患兒感染標本的耐藥情況進行檢測，紅霉素耐藥突變率達到90%[7]。本次研究中，發(fā)現(xiàn)28例臨床樣本23S rRNA基因2063位點發(fā)生A到G的耐藥突變，1例發(fā)生了A到T點突變，耐藥基因總突變率65.9%，低于其他各地的研究報道。臨床資料分析顯示，A2063G/T點突變組發(fā)熱持續(xù)時間、藥物用時、住院天數(shù)上均高于敏感組，而C反應蛋白和血沉均低于敏感組，提示大環(huán)內(nèi)酯類相關基因突變與臨床上難治性肺炎之間的相關性仍需進一步探索。

本次研究結(jié)果顯示2015—2016年無錫地區(qū)MP陽性檢出率為8.68%，2016年MP陽性率較2015年有上升趨勢，其中主要基因型為MP P1-1型，但P1-2基因型比例明顯高于其他各地的報道，近年有型別轉(zhuǎn)換的可能。但此次研究也發(fā)現(xiàn)MLVA分型與P1基因分型在很大程度上有重合，并未能將肺炎支原體基因型做出較大的區(qū)分度，尋求更優(yōu)的基因分型仍是分析亞型的重要研究方向，這樣才能建立與臨床特征聯(lián)系，才能更好的指導臨床和流行病學監(jiān)控。無錫地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因23S rRNA的2063位點突變率相對其他各地較低，仍需進一步縱向監(jiān)測。