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類鼻疽病(Melioidosis)是一種流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)的自然疫源性傳染病,可引起敗血癥、肺炎等嚴(yán)重臨床表現(xiàn)，死亡率高達(dá)20%～40%[1]。此病的致病菌-類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei, 簡稱類鼻疽伯克菌)是一種革蘭氏陰性腐生菌，棲息于熱帶地區(qū)的土壤、水體中，主要通過皮膚接觸、氣溶膠吸入、消化道等途徑感染人和動物。類鼻疽的感染、發(fā)病通常受氣候、宿主免疫狀態(tài)、職業(yè)暴露機(jī)會等因素影響，但環(huán)境中是否存在類鼻疽伯克菌是判定類鼻疽疫源地的決定因素[1]。在東南亞、澳大利亞北部等世界主要類鼻疽流行區(qū)，高發(fā)病率與環(huán)境中類鼻疽伯克菌的高分離率呈正相關(guān)[2]。

海南省于1990年首次發(fā)現(xiàn)人類鼻疽病例[3]，目前已成為我國類鼻疽病危害最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。然而，目前對該地區(qū)類鼻疽流行病學(xué)，尤其病原菌的生態(tài)、地理分布特征，傳播方式，感染途徑等尚不明確，嚴(yán)重影響了防控工作的開展。以往曾有自海南外環(huán)境分離出類鼻疽伯克菌及其近緣相似菌-泰國伯克霍爾德菌的報道[4]。但以上研究中環(huán)境類鼻疽伯克菌的低分離率與當(dāng)前海南類鼻疽的流行態(tài)勢不能吻合，提示可能存在尚未了解的流行影響因素。此外，在海南地區(qū)，盡管已經(jīng)證實外環(huán)境中存在類鼻疽伯克菌，但環(huán)境菌株與致病菌株間的關(guān)聯(lián)尚未被證實過，這需要菌株間的遺傳信息比對提供直接證據(jù)。

為深入了解海南地區(qū)類鼻疽病的流行原因，我們對海南一例類鼻疽患者的居住環(huán)境進(jìn)行了病原學(xué)調(diào)查；通過基于分子分型技術(shù)的菌株同源性比對，進(jìn)一步明確了感染來源，為類鼻疽疫情的科學(xué)防控提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病史 患者為男性，海南省三亞市某農(nóng)場農(nóng)民，于2014年6月因高熱、泌尿道感染入院治療。病人患糖尿病多年。病原學(xué)檢查：采集患者尿道分泌物、靜脈血；前者直接接種血平板，后者經(jīng)血培養(yǎng)培養(yǎng)物接種血平板；分離出類鼻疽伯克菌各1株，分別命名為HN186，HN187(表2)。臨床診斷：糖尿病合并類鼻疽性敗血癥；類鼻疽性泌尿系感染；膿毒血癥。病人經(jīng)美羅培南聯(lián)合左氧氟沙星抗感染治療，病愈出院。

1.2環(huán)境樣品采集與菌株分離 病人住院期間，經(jīng)患者及家屬同意，參照“國際類鼻疽工作組”推薦的類鼻疽伯克菌環(huán)境采樣策略及分離方案[5]，采集患者居住地周圍的泥土、稻田水、井水等環(huán)境樣品共58份(29個采樣點，每個點采樣2份，采樣量每份約50 g，見表1)，立即送實驗室進(jìn)行菌株分離。簡述如下：1)取10 g樣品，加入Ashdown液體培養(yǎng)基20 mL，震蕩培養(yǎng)24 h(42 ℃)；2)吸取培養(yǎng)物100 μL，涂布于Ashdown選擇性平板，37 ℃孵育，至48 h后每日觀察菌落形態(tài)特征；3)挑取粉紅或淺紫色、扁平、周邊皺褶，有金屬光澤的類鼻疽伯克菌疑似菌落，接種于Ashdown選擇性平板用于進(jìn)一步鑒定。

1.3 細(xì)菌學(xué)鑒定

1.3.1使用類鼻疽抗原檢測膠體金試劑進(jìn)行血清學(xué)鑒定，讀取結(jié)果并記錄。

1.3.2參照文獻(xiàn)[4]，通過16S rDNA基因序列，三型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，TTSS1)、伯克霍爾德菌致死因子(BurkholderiaLethal Factor 1，BLF1)等類鼻疽伯克菌特異毒力因子的攜帶情況對疑似菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3PCR檢測泰國伯克菌樣鞭毛基因簇(BurkholderiaThailandensis-like flagellar gene cluster, BTFC)/ 耶爾森菌樣菌毛基因簇(Yersinia-like fimbrial gene cluster, YLF)攜帶情況[6]。BTFC引物：Btfc_orf18_forward(5′-GTC GAT TTC GGC TGC GAA ACA ACA-3′)，Btfc_orf18_reverse(5′-ATG CCG TCG CAA CCA TTG ATG ATG-3′)；YLF引物：BPSS0120_forward(5′-TGA CCC ATT CAG GCA AGG GAT TCT-3′)，BPSS0120_reverse(5′-TCC GTC CTG TTC GGT GAT TTC GAT-3′)。PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同上。

1.4 分子分型及同源性分析

1.4.1多位點序列分型(MLST) 參照文獻(xiàn)[7]，收集菌株培養(yǎng)物并提取染色體DNA，然后進(jìn)行ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh等7個等位基因的PCR擴(kuò)增及測序。測序結(jié)果校對后提交類鼻疽伯克菌MLST 數(shù)據(jù)庫(http：//bpseudomallei.mlst.net)，獲得等位基因序列號并確定菌株序列型(ST)。

1.4.2脈沖場凝膠電泳(PFGE) 實驗步驟及電泳參數(shù)與以往文獻(xiàn)相同[8]，采用BioNumerics 5.0軟件(比利時Applied Maths公司)進(jìn)行同源比對及聚類分析。

1.4.3多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA) 參照Bart等建立的類鼻疽伯克菌MLVA_4分型方案[9]，提取菌株染色體DNA，然后進(jìn)行4個VNTR位點(2341,1788,933,389)的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)GeneScan 500 LIZ DNA Marker(美國ABI公司)確定擴(kuò)增產(chǎn)物長度。根據(jù)產(chǎn)物長度計算各VNTR位點的重復(fù)次數(shù)，并獲得MLVA_4指紋譜。

2 結(jié) 果

2.1環(huán)境樣品種類及菌株分離結(jié)果 采集的環(huán)境樣品分為4種類型：患者居住地周圍泥土、患者家芒果園泥土、患者家稻田泥土、患者及鄰居家水井水；29個采樣點的類型分布見表1。58份環(huán)境樣品中共分離出3株類鼻疽伯克菌的疑似菌：HN85e、HN86e、HN161e，均來源于水井水(表1)。其中，HN85e、HN86e自類鼻疽患者家水井水分離，HN161e自鄰居家水井水分離，兩井相距約80 m。

表1 環(huán)境樣品類型、分布及類鼻疽伯克菌分離培養(yǎng)結(jié)果
Tab.1 Types and distribution of environmental samples, results of isolation and culture of Burkholderia pseudomallei

環(huán)境樣品種類采集樣品數(shù)量疑似菌株數(shù)量所占百分比(%)患者居住地周圍泥土1600患者家芒果園泥土800患者家稻田泥土3000患者及鄰居家水井水4375共計5835

2.2 分離菌株細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1類鼻疽抗原血清學(xué)鑒定結(jié)果 HN186、HN187、HN85e、HN86e、HN161e均為陽性。

2.2.216S rDNA序列分析 經(jīng)測序比對，病人分離株(HN186、HN187)、環(huán)境分離株(HN85e、HN86e、HN161e)的16S rDNA序列與類鼻疽伯克菌測序株K96243的16S rDNA序列同源性為100%。

2.2.3毒力基因攜帶情況 經(jīng)檢測，病人分離株(HN186、HN187)、環(huán)境分離株(HN85e、HN86e、HN161e)均攜帶TTSS1及BLF1相關(guān)基因(表2)。

2.2.4BTFC/YLF基因簇是重要的類鼻疽種群(澳大利亞/東南亞)指示標(biāo)簽[6]，并且可用于類鼻疽伯克菌分子診斷。通過PCR檢測，HN186、HN187、HN85e、HN86e、HN161e均為BTFC陰性，YLF陽性，符合東南亞群類鼻疽伯克菌特征(表2)。

表2 病人臨床分離株、環(huán)境分離株來源及特異診斷基因攜帶情況
Tab.2 Sources of clinical isolates, environmental isolates and carrying status of specific diagnostic genes

菌株名稱來源TTSS1BLF1BTFCYLFHN186患者血液++-+HN187尿道分泌物++-+HN85e患者家井水++-+HN86e患者家井水++-+HN161e患者鄰居家井水++-+

2.3 分子分型及同源性比對結(jié)果

2.3.1MLST分型 病人分離株HN186、HN187的ST型別相同，均為ST677(指紋譜：1,1,3,1,1,22,1)。環(huán)境分離株中，HN85e(ST677)與病人菌株ST型相同；HN86e(ST1394，指紋譜：1,1,6,1,1,29,3)、HN161e(ST376，指紋譜：1,4,2,3,8,4,3)與病人分離株分別在3個和6個等位基因存在差異。

2.3.2PFGE分型 病人分離株HN186與3株環(huán)境分離株的帶型比對見圖1。HN186與環(huán)境菌株HN85e帶型相似度為100%；與HN86e、HN161e差異較大，帶型相似度分別為82%、76%。

2.3.3MLVA_4指紋譜 病人分離株HN186、HN187的MLVA_4指紋譜與環(huán)境菌株HN85e相同(5,4,8,2)；與其余兩株環(huán)境菌株HN86e、HN161e完全不同(圖1)。

圖1 病人分離株HN186與3株環(huán)境菌株的PFGE比對圖Fig.1 Comparison of PFGE between HN186 isolated from patients and 3 strains of environmental strains

3 討 論

溯源調(diào)查是傳染病疫情處理過程中的重要環(huán)節(jié)，對于明確病原體來源，判斷感染原因，制訂防控措施意義重大。近年來，海南地區(qū)類鼻疽流行呈上升趨勢，但是相關(guān)病例的感染源調(diào)查工作開展較少，對病原來源、感染方式的認(rèn)知往往基于經(jīng)驗或者國外文獻(xiàn)報道，缺乏實證，已經(jīng)不能滿足類鼻疽防控工作的要求。本次調(diào)查通過環(huán)境樣品采集、菌株分離鑒定、分子特征比對等工作，發(fā)現(xiàn)并證實了一例類鼻疽病人的臨床分離菌株與其自家水井水分離菌株同源，因此水井水很可能是引起類鼻疽病的感染源。以往海南類鼻疽流行病學(xué)報道中，農(nóng)民占較大比例，因此推測職業(yè)暴露尤其水稻種植是海南類鼻疽病感染的重要原因[10]。本調(diào)查在病人家稻田、芒果園樣品中未分離出類鼻疽伯克菌，但在居住地水井中分離到三株類鼻疽伯克菌，提示社區(qū)環(huán)境污染導(dǎo)致的類鼻疽感染應(yīng)引起關(guān)注。與職業(yè)暴露相比，生活用水由于接觸機(jī)會多，感染途徑(皮膚接觸、氣溶膠、消化道等)多，因此引發(fā)類鼻疽病的危險性更大，可能引發(fā)更加嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。2011年及2012年，澳洲北部、泰國東北部均有生活用水污染引起類鼻疽流行的報道[11-12]。針對這一情況，衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)水井等供水設(shè)施的衛(wèi)生檢測、衛(wèi)生清理工作，保證水源安全；同時廣泛開展類鼻疽病相關(guān)宣教工作，提高居民尤其糖尿病等易感人群對類鼻疽病及其防護(hù)措施的認(rèn)知度。

分子分型技術(shù)在類鼻疽病疫情調(diào)查及溯源中已有成功應(yīng)用。Mark等通過比較澳大利亞達(dá)爾文地區(qū)類鼻疽環(huán)境分離株、臨床分離株的ST型別譜，發(fā)現(xiàn)部分臨床菌株與井水分離株ST型相同，推測水井可能是重要類鼻疽感染源[12]。Bart等比較了澳洲北部一起類鼻疽暴發(fā)流行臨床分離菌株的PFGE指紋譜，確認(rèn)所有菌株為同一來源，并且與當(dāng)?shù)毓┧到y(tǒng)中類鼻疽分離菌株同源[13]。然而，類鼻疽伯克菌基因組學(xué)研究表明，受重組、回復(fù)突變、分辨能力等影響，僅依靠MLST或者PFGE的一致性，不能充分證明菌株相關(guān)性[14]。本次研究，我們引入了更加靈敏的MLVA-4分型方案。以上3種遺傳標(biāo)志，從不同方面證實外環(huán)境菌株與臨床菌株間的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)，可靠性更高。

此次調(diào)查，明確了患者的感染來源，并為證明海南地區(qū)是類鼻疽的自然疫源地提供了實例。然而，相關(guān)病例感染途徑、居民區(qū)水井被類鼻疽伯克菌污染的程度及原因等仍不確定，今后需進(jìn)行更加廣泛的流行病學(xué)調(diào)查工作。