， ，， ，，

裂頭蚴病是由猬迭宮絳蟲的幼蟲寄生人體所致的人獸共患病[1]。迄今，我國(guó)已有1 000多例報(bào)告，來(lái)自于全國(guó)27個(gè)省、市、自治區(qū)[2]。人體裂頭蚴病的臨床表現(xiàn)因寄生部位不同而異，診斷主要依賴于局部發(fā)現(xiàn)裂頭蚴或蟲體的殘端組織[3]，因裂頭蚴病常表現(xiàn)為慢性感染過(guò)程且臨床癥狀不典型，臨床上對(duì)裂頭蚴結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)不足給診斷帶來(lái)困擾。為提高裂頭蚴病的病原診斷水平，近年來(lái)，人們開展了裂頭蚴病的分子病理診斷研究[4-6]。從含有蟲體殘端組織的切片中提取并分析其結(jié)構(gòu)，一定程度上彌補(bǔ)了普通病原學(xué)診斷的不足，提高該病的檢出率。而在分子病理診斷中，提取病理切片中的DNA是關(guān)鍵步驟[7-11]。目前DNA提取試劑盒層出不窮，而不同的試劑盒提取的效果及速度等存在很大差異。對(duì)于不同目的和條件的實(shí)驗(yàn)，需要選擇不同的試劑盒以滿足后續(xù)的分析檢測(cè)[12-15]。

考慮到裂頭蚴病臨床類型特點(diǎn)，人工建立小鼠皮下肌肉裂頭蚴病動(dòng)物模型，取有裂頭蚴寄生的皮下肌肉組織塊制作病理組織切片[16]，用4種商品試劑盒平行提取切片中裂頭蚴DNA，比較提取效果，為裂頭蚴病臨床分子病理診斷選用試劑盒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)源 裂頭蚴：采集貴州安順等地的野生王錦蛇，自蛇體內(nèi)檢獲猬裂頭蚴，并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)蟲種。檢獲的裂頭蚴用于小鼠感染。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠30只，20～25 g，雌雄各半，引自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)(合格證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001)。

1.1.3DNA提取試劑盒 試劑盒1(QIAamp DNA FFPE Tissue kit)購(gòu)自廣州健倫生物科技有限公司(德國(guó)QIAGEN公司)；試劑盒2購(gòu)自大連寶生物有限公司；試劑盒3購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物有限公司；試劑盒4購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司。

1.1.4引物序列 根據(jù)目的基因，參考Jeon等[17]的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)cox1基因引物。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。序列如下：

cox1-F：5′-CGGCTTTTTTTGATCCTTTGG-GTG-3′

cox1-R：5′-GTATCATATGAACAACCTAA-TTTAC-3′

1.2 方法

1.2.1小鼠感染模型的建立及病理組織切片的制備 將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組25只和對(duì)照組5只。用蛇源裂頭蚴經(jīng)口服法感染實(shí)驗(yàn)組小鼠(5條/只)，對(duì)照組不做任何處理，相同條件飼養(yǎng)。2周后對(duì)感染小鼠進(jìn)行解剖，取含裂頭蚴寄生的皮下肌肉組織(有蟲組織)20塊及健康小鼠相對(duì)應(yīng)的皮下肌肉組織(對(duì)照組織)5塊，每塊大小為1 cm3。用10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)方法制成組織白片及HE染色片，切片厚度為7.0 μm。

1.2.2DNA的提取 用4種商品試劑盒平行提取有蟲組織白片或HE染色片(5片)中的DNA，提取的方法和條件按試劑盒提供的操作流程進(jìn)行。比較提取DNA的數(shù)量與質(zhì)量，所需時(shí)間及成本。DNA樣本于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以改良蛋白酶K消化法(脫蠟時(shí)間3 h，蛋白酶K濃度為1 500 μg/mL，消化時(shí)間24 h)為對(duì)照，比較提取DNA的數(shù)量與質(zhì)量，所需成本及時(shí)間，并將4種試劑盒提取的DNA作PCR擴(kuò)增，觀察不同試劑盒提取DNA的擴(kuò)增效果。

1.2.3 目的基因作PCR擴(kuò)增的條件

1.2.3.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 總體積為20 μL，DNA提取物 1 μL，2×Taq PCR Master Mix試劑10 μL，上、下游引物各1.5 μL，加雙蒸水6 μL。

1.2.3.2PCR擴(kuò)增程序 95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增時(shí)以雙蒸水作陰性對(duì)照。

1.2.4DNA濃度、純度及提取率的檢測(cè) 取2 μL提取的DNA用紫外分光光度計(jì)讀取DNA濃度和A260/A280比值(DNA純度)。

2 結(jié) 果

2.1提取純度及濃度的比較 用4種商品試劑盒平行提取裂頭蚴有蟲組織白片DNA，提取純度及濃度效果為：試劑盒1=試劑盒2>試劑盒3>試劑盒4；用4種商品試劑盒平行提取有蟲組織HE染色片的DNA，其提取純度及濃度效果為：試劑盒1=試劑盒2>試劑盒3=試劑盒4；對(duì)4種試劑盒的成本及提取時(shí)間進(jìn)行比較：試劑盒1的成本最高耗時(shí)較短，試劑盒2的成本較低耗時(shí)最短，試劑盒3的成本最低耗時(shí)也最長(zhǎng)，試劑盒4的成本略高于試劑盒3，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)(表1、2)。

表1 4種試劑盒提取有蟲組織白片DNA濃度及純度的情況
Tab.1 Concentration and purity of DNA by four different kits

試劑盒DNA純度A260/A280DNA濃度(ng/μL)成本(元/μgDNA)提取時(shí)間改良蛋白酶K法1.850±0.048371.008±14.6212027 h試劑盒11.852±0.057373.858±24.65618530 min試劑盒21.814±0.001354.005±12.7279025 min試劑盒31.776±0.059ab314.005±12.727ab5526 h試劑盒41.664±0.107abcd304.998±15.046abcd563 hχ218.0681694.106P<0.01<0.01

注：在同一列數(shù)據(jù)，a：與改良蛋白酶K法相比P<0.01，b：與試劑盒1相比P<0.01，c：與試劑盒2相比P<0.01， d：與試劑盒3相比P<0.01。AOD：平均光密度值

表2 4種試劑盒提取有蟲組織HE染色片DNA濃度及純度的情況
Tab.2 Concentration and purity of DNA by four different kits

試劑盒DNA純度A260/A280DNA濃度(ng/μL)成本(元/μgDNA)提取時(shí)間改良蛋白酶K法1.861±0.076318.082±14.7212027 h試劑盒11.863±0.001327.051±33.20918530 min試劑盒21.861±0.001317.051±13.2489025 min試劑盒31.669±0.017abc273.858±24.656abc5526 h試劑盒41.704±0.447abc274.998±15.046abc563 hχ210.1682 530.685P<0.05<0.01

注：在同一列數(shù)據(jù)，a：與改良蛋白酶K法相比P<0.01，b：與試劑盒1相比P<0.01，c：與試劑盒2相比P<0.01， d：與試劑盒3相比P<0.01。AOD：平均光密度值

2.2提取率的比較 隨機(jī)抽取有蟲組織15個(gè)樣本，每份樣本5片。用4種試劑盒進(jìn)行DNA的提取,并與改良蛋白酶K法進(jìn)行比較。改良蛋白酶K法的提取率為100%，而試劑盒1-4的提取率分別為100%、93.3%、80%及73.3%(表3)。

表3 4種試劑盒提取蟲體組織白片樣品DNA提取率
Tab.3 Extraction rate of DNA by four different kits

試劑盒樣本數(shù)陽(yáng)性數(shù)提取率(%)試劑盒11515100試劑盒2151493.3試劑盒3151280.0試劑盒4151173.3改良蛋白酶K法1515100

2.34種試劑盒與改良蛋白酶K消化法提取效果比較 用4種試劑盒及改良蛋白酶K消化法分別對(duì)有蟲組織白片及HE染色片進(jìn)行DNA提取，提取的DNA作PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果均有150 bp特異條帶出現(xiàn)在相位的位置上，試劑盒4的條帶相對(duì)較暗(圖1、2)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-3：改良蛋白酶K法；4-6：試劑盒4提取結(jié)果；7-9：試劑盒3提取的結(jié)果；10-12：試劑盒2提取的結(jié)果；13-15：試劑盒1提取的結(jié)果；16-17：對(duì)照組織(改良蛋白酶K法)圖1 4種試劑盒與改良蛋白酶K消化法提取白片效果的比較Fig.1 Comparison of the DNA extracted from white slices by four kits and modified proteinase K method

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1-2：改良蛋白酶K法；3-4：試劑盒4提取結(jié)果；5-6：試劑盒3提取的結(jié)果；7-8：試劑盒2提取的結(jié)果；9-10：試劑盒1提取的結(jié)果；11-12：對(duì)照組織(改良蛋白酶K法)圖2 4種試劑盒與改良蛋白酶K消化法提取HE染色片效果的比較Fig.2 Comparison of the DNA extracted from HE stained slices by four kits and modified proteinase K method

3 討 論

近年來(lái)有多種商業(yè)化的試劑盒可供提取石蠟包埋組織切片中的DNA。試劑盒操作簡(jiǎn)單規(guī)范深受用戶喜歡，但不同的試劑盒，其提取DNA的濃度、純度、提取率以及價(jià)格等仍存在很大差別。本實(shí)驗(yàn)選取四種試劑盒平行提取了裂頭蚴石蠟包埋蟲體組織白片和HE染色片的效果，對(duì)提取所需時(shí)間、提取的質(zhì)量、提取率及價(jià)格等方面進(jìn)行了比較，并用改良蛋白酶K法進(jìn)行驗(yàn)證。

4種試劑盒提取的DNA純度(A260/A280)均在正常范圍，說(shuō)明DNA既沒有被過(guò)多破壞，也沒摻入RAN、氯仿等雜質(zhì)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后在150 bp的位置出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，提取效果均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。試劑盒1有脫蠟、裂解、加熱、結(jié)合、洗滌和洗脫6步，操作過(guò)程時(shí)間較短組織裂解充分，DNA降解程度小，提取的DNA純度、濃度均較高，但成本也最高。試劑盒2無(wú)需脫蠟，不接觸有害溶劑，既安全又縮短了操作時(shí)間，但吸取DNA水層時(shí)易污染，較適合400 bp以下的DNA片段擴(kuò)增，有一定的局限性。試劑盒3操作相對(duì)復(fù)雜需過(guò)夜，肉眼判斷組織片變色情況易產(chǎn)生誤差，且耗時(shí)最長(zhǎng)，不適用于DNA的快速提取。試劑盒4不需過(guò)夜操作，耗時(shí)相對(duì)適中，但孵育溫度高時(shí)間長(zhǎng)易引起組織結(jié)構(gòu)破壞，提取DNA的效果最差。改良蛋白酶K法提取的DNA也能達(dá)到要求，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需接觸有害物質(zhì)，不利于廣泛推廣使用。近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)試劑盒的品質(zhì)在不斷提高，在某些方面甚至優(yōu)于國(guó)外試劑盒。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為臨床的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)仍存在不足，所用的病理標(biāo)本均為小鼠模型標(biāo)本，如能有相應(yīng)的臨床病人標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，將有利于提取條件的進(jìn)一步完善，使裂頭蚴病的分子病理診斷更進(jìn)一步。