楊苗苗，員君華，張歡歡，張國(guó)艷，Hossain Zabed，齊向輝

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基于甘油的1,3-丙二醇生物合成的代謝局限及其改造策略

楊苗苗*，員君華*，張歡歡，張國(guó)艷，Hossain Zabed，齊向輝

江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

金城. 2018酶工程專刊序言. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

粗甘油是生物柴油生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，一些微生物可將甘油轉(zhuǎn)化為重要化工原料1,3-丙二醇 (1,3-PD)，而利用這些微生物野生菌株生物合成1,3-PD會(huì)存在一些局限性，如底物抑制、產(chǎn)物抑制等。文中從1,3-丙二醇的甘油生物轉(zhuǎn)化途徑與這些局限性出發(fā)，總結(jié)了生物合成中存在的問(wèn)題，并針對(duì)這些問(wèn)題提出了一些基于基因敲除或基因過(guò)表達(dá)等基因工程技術(shù)的改造方法，綜述了利用基因工程菌生物轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-丙二醇的最新研究進(jìn)展。

甘油，1,3-丙二醇，生物轉(zhuǎn)化，生物合成，基因工程

1,3-丙二醇 (1,3-propanediol，1,3-PD) 是一種無(wú)色物質(zhì)，味道微甜，具有粘性，易溶于水和乙醇，在化工、食品、醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用[1-5]。1,3-PD可以通過(guò)化學(xué)途徑合成，但合成工藝條件苛刻、能耗高、釋放有毒中間體且產(chǎn)品精制難度較大，這些都增加了1,3-PD的生產(chǎn)成本[6]。因此，尋找一種低成本、低能耗的代替方法，將為1,3-PD的生產(chǎn)帶來(lái)巨大效益。粗甘油是生物柴油生產(chǎn)中的一種主要副產(chǎn)物[7-9]，自然條件下一些微生物可以直接利用甘油作為底物，高效地合成1,3-PD，這不僅解決了1,3-PD化學(xué)法生產(chǎn)成本較高的問(wèn)題，又有效地回收利用了生物柴油生產(chǎn)中的副產(chǎn)品。這些1,3-PD生產(chǎn)菌株包括短乳桿菌、肺炎克雷伯菌、巴氏梭狀芽孢桿菌、丁酸梭菌和弗氏檸檬菌等[10-16]。盡管上述自然界中分離的野生菌用于生產(chǎn)1,3-PD具有較高的效率，但這些菌本身的某些性質(zhì)限制了其產(chǎn)率的繼續(xù)提高，利用基因工程的技術(shù)對(duì)這些野生菌進(jìn)行定向改造[17]，可以打破這些限制，甚至可以對(duì)本身不能進(jìn)行甘油轉(zhuǎn)化生成1,3-PD的菌株進(jìn)行基因工程手段的改造，引入1,3-PD代謝途徑來(lái)生產(chǎn)1,3-PD。例如，美國(guó)杜邦公司利用利用玉米中的糖分為底物，將、和可轉(zhuǎn)化糖為甘油的基因克隆到工程菌中，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為底物生產(chǎn)1,3-PD，并用于工業(yè)化生產(chǎn)，被公認(rèn)為是利用基因工程方法使代謝物產(chǎn)業(yè)化的典范?；蚬こ谭椒ㄈ缜贸拖嚓P(guān)基因的過(guò)表 達(dá)均可被用來(lái)構(gòu)建高效或高產(chǎn)的1,3-PD工程菌株。

1 1,3-PD的生物合成

1.1 生物合成途徑

在自然條件中，甘油歧化是1,3-PD的唯一生成途徑，一般在厭氧條件下進(jìn)行[18-21]。在這些微生物中，甘油可以通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散或促進(jìn)擴(kuò)散兩種不同方式滲透到膜中[22]，當(dāng)甘油跨過(guò)細(xì)胞膜后，會(huì)進(jìn)入兩個(gè)平行的代謝途徑：氧化代謝途徑和還原代謝途徑(圖1)。

在氧化途徑分支中，甘油在甘油脫氫酶 (Glycerol dehydrogenase，GDH)的催化下，生成二羥丙酮 (Dihydroxyacetone，DHA)，這步反應(yīng)需要NAD+作為輔酶；之后，DHA在ATP的參與下，經(jīng)磷酸二羥丙酮激酶 (Dihydroxyacetone kinase，DHAK) 催化生成磷酸二羥丙酮 (Dihydroxyacetone phosphate，DHAP)，再在NAD+輔酶參與下，生成磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)，之后進(jìn)入碳代謝如糖酵解、三羧酸循環(huán)等主流代謝途徑和其他代謝途徑[23-24]。由PEP轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的丙酮酸會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，如乙酸、琥珀酸、乳酸、丁酸、正丁醇、乙醇、2,3-丁二醇 (2,3-butanediol，2,3-BD) 等，這些代謝產(chǎn)物構(gòu)成了利用微生物生產(chǎn)1,3-PD的主要副產(chǎn)物。

另一分支是還原途徑分支。甘油首先在甘油脫水酶 (GDHt，glycerol dehydratase) 的作用下生成3-羥基丙醛 (3-hydroxypropanaldehyde，3- HPA)，GDHt是控制甘油分解的限速酶，對(duì)甘油轉(zhuǎn)化起著至關(guān)重要的作用。隨后，經(jīng)1,3-丙二醇氧化還原酶 (1,3-propanediol oxidoreductase，PDOR) 催化，3-HPA轉(zhuǎn)化為1,3-PD[25]。在從甘油到1,3-PD厭氧轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，當(dāng)所有的乙酰CoA均進(jìn)入TCA循環(huán)，未經(jīng)氧化磷酸化生成乙酸，其最大理論產(chǎn)量為0.875 mol/mol甘油。然而，在大多數(shù)情況下，為了產(chǎn)生更多的ATP，乙酸大量生成，此時(shí)以乙酸為唯一副產(chǎn)物的最大理論收率為0.72 mol/mol[17]。鑒于通過(guò)生物合成1,3-PD的諸多優(yōu)點(diǎn)，利用甘油合成1,3-PD是目前的研究熱點(diǎn)。然而，生物轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-PD亦存在著一些局限性，利用基因工程的方法來(lái)改造微生物菌株，可以有效改善這些問(wèn)題，表1列出了這些工程菌生產(chǎn)1,3-PD的情況。

圖1 甘油的代謝通路圖[26]

1.2 轉(zhuǎn)化途徑中的關(guān)鍵酶及其基因

由上述甘油的還原途徑可見(jiàn)，GDHt (EC 4.2.1.30) 和PDOR (EC 1.1.1.202) 是生物法生產(chǎn)1,3-PD的兩種關(guān)鍵酶，而編碼該關(guān)鍵酶的基因存在于dha調(diào)節(jié)子上，該調(diào)節(jié)子包括GDHt的編碼基因 ()、PDOR的編碼基因 ()、GDH的編碼基因 ()、DHAK的編碼基因 ()和調(diào)節(jié)基因 ()，不同1,3-PD生產(chǎn)菌的調(diào)節(jié)子構(gòu)成亦不同。

GDHt是甘油歧化途徑中的關(guān)鍵功能性分子，是1,3-PD生物轉(zhuǎn)化中的限速酶。在的調(diào)節(jié)子中，編碼GDHt的基因是，由3個(gè)閱讀框 (、、) 分別編碼該酶的3個(gè)功能亞基，即α、β和γ亞基，它們共用一個(gè)啟動(dòng)子，以α2β2γ2二聚體的形式存在。而的GDHt是由、編碼的，其結(jié)構(gòu)與中的GDHt同源，具有較高的相似性，這兩種GDHt均以輔酶維生素B12為輔基，在1,3-PD發(fā)酵過(guò)程中微量流加B12，可以滿足微生物轉(zhuǎn)化的需要。而在中，GDHt的編碼基因由1、2組成，1編碼2的激活蛋白，該菌中的GDHt對(duì)氧氣極其敏感，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)，但中的GDHt并不是輔酶維生素B12依賴型，由于輔酶B12成本較高，這也使得工業(yè)上利用生物轉(zhuǎn)化1,3-PD具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

PDOR由基因編碼，是甘油與1,3-PD代謝途徑中的另一關(guān)鍵性酶，直接將甘油還原途徑中的中間產(chǎn)物3-HPA還原為1,3-PD，同時(shí)消耗NADH生產(chǎn)NAD+，微生物通過(guò)該反應(yīng)步驟消耗還原力NADH，使微生物細(xì)胞內(nèi)的還原力達(dá)到平衡。在中由連續(xù)基因編碼，轉(zhuǎn)錄方向與甘油脫水酶基因相反，由另一啟動(dòng)子控制；而在調(diào)節(jié)子中，兩種酶的編碼基因在同一方向轉(zhuǎn)錄。在1,3-PD生產(chǎn)途徑中，PDOR酶的活性會(huì)受到許多抑制，導(dǎo)致1,3-PD產(chǎn)量降低，因此，為實(shí)現(xiàn)、基因的高效表達(dá)，構(gòu)建載體時(shí)須借鑒自然菌中基因簇的排布模式。表2列出了應(yīng)用不同的蛋白改造方法對(duì)以上兩種酶的改造策略。

2 甘油轉(zhuǎn)化生成1,3-PD過(guò)程中的底物抑制與產(chǎn)物抑制

甘油以及1,3-PD產(chǎn)物的積累都對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且導(dǎo)致了GDHt不可逆的失活，降低了1,3-PD的產(chǎn)率。Colin等[27]研究了CNCM1211中甘油和1,3-PD對(duì)細(xì)菌的抑制作用，結(jié)果表明，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率與甘油的濃度成反比，當(dāng)甘油初始添加濃度達(dá)到150 g/L時(shí)菌體的生長(zhǎng)受到明顯抑制，濃度達(dá)到160 g/L時(shí)，細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)1,3-PD的初始添加量達(dá)到65 g/L時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)率達(dá)到最大值，由于甘油的代謝產(chǎn)生1,3-PD，1,3-PD在培養(yǎng)基中的終濃度為70 g/L。Daria等[28]也研究了1,3-PD對(duì)DSP1生產(chǎn)性能的影響，在接種之前將1,3-PD添加到培養(yǎng)基中，得出了相近的結(jié)果，當(dāng)外源添加的1,3-PD濃度達(dá)到60 g/L時(shí)，菌株的活性相對(duì)較高，添加的初始濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，對(duì)菌體來(lái)說(shuō)是致命的。

由于GDHt是1,3-PD發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵酶，尤其是在甘油濃度較高時(shí)，提高酶的濃度或活性可以有效提高1,3-PD的產(chǎn)率[29]。首先，利用基因工程的技術(shù)對(duì)GDHt編碼基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)是一個(gè)有效的解決方案。Oh等[30]首先獲得了一株不產(chǎn)生副產(chǎn)物的突變株，命名為AK-VOT，通過(guò)去除甘油氧化途徑，阻斷除乙酸外其他副產(chǎn)物的生成，獲得了1,3-PD高產(chǎn)菌株，之后，過(guò)表達(dá)和/或基因，進(jìn)一步研究以期提高1,3-PD產(chǎn)量。結(jié)果表明，相比于和基因同時(shí)過(guò)表達(dá)，單獨(dú)過(guò)表達(dá)的突變株1,3-PD的產(chǎn)量較高。其次，采用定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)或非理性設(shè)計(jì)的方法對(duì)酶分子進(jìn)行改造，獲得活性更高、穩(wěn)定性更好的新型GDHt，也可將甘油底物盡快轉(zhuǎn)化。Qi等[31-32]采用生物信息學(xué)的方法對(duì)GDHt進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)，并研究了重組酶在不同pH值下的酶活力及穩(wěn)定性，酶學(xué)性質(zhì)的分析表明，相比于原始酶，經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變理性設(shè)計(jì)的酶的活力提高到1.5–2.0倍， 對(duì)pH的穩(wěn)定性也提高到原始酶的1.5–2.0倍；采用易錯(cuò)PCR的非理性改造和定點(diǎn)飽和突變理性改造相結(jié)合的方法得到的改造GDHt酶活力提高到8.3倍。利用這種改造后的酶進(jìn)行1,3-PD的發(fā)酵，也可以促進(jìn)底物的盡快轉(zhuǎn)化，減少抑制。一些對(duì)1,3-PD具有較高耐受性的菌種也被分離獲得，例如，Papanikolaou等[33]選用的是從死水池中分離得到的F2b，該菌株表現(xiàn)出良好的1,3-PD耐受性，耐受水平達(dá)到80 g/L。VPI 3266和DSM 5431也具有較高的1,3-PD耐受性[23]，其1,3-PD產(chǎn)量確有提高。利用誘變育種的方式對(duì)菌株進(jìn)行定向進(jìn)化，經(jīng)過(guò)高通量篩選也可能獲得1,3-PD的高耐受菌株，同時(shí)這也是解決底物抑制的方法之一。另外，采用連續(xù)發(fā)酵的方式將代謝產(chǎn)物移除，對(duì)于提高產(chǎn)量也有一定的益處。

3 中間產(chǎn)物3-HPA的及時(shí)轉(zhuǎn)化

3-HPA能夠阻止細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)，廣泛應(yīng)用于生物殺菌劑和抗感染治療劑。其確切機(jī)制目前尚不十分清楚[34]。在甘油還原生成1,3-PD時(shí)，3-HPA是其中間產(chǎn)物，它不僅會(huì)延緩細(xì)菌的生長(zhǎng)，而且GDHt和PDOR都對(duì)高濃度的3-HPA極其敏感，培養(yǎng)基中3-HPA的積累會(huì)導(dǎo)致微生物中的反饋機(jī)制的觸發(fā)，降低GDHt的合成以降低3-HPA的生成水平，減少對(duì)菌體的毒害作用[35]，從而導(dǎo)致1,3-PD的生成水平也相應(yīng)降低，這個(gè)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致代謝活動(dòng)中不可逆轉(zhuǎn)的后果，成為1,3-PD生產(chǎn)中的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，也是1,3-PD生產(chǎn)中一個(gè)主要的影響因素[36]。因此，PDOR的濃度或活性是代謝中的關(guān)鍵影響因子，在保證GDHt一定活力的情況下，研究者們主要采取以下方法來(lái)降低3-HPA的影響。

3.1 提高PDOR活力

PDOR是一種氧化還原酶，許多學(xué)者研究了其氧化與還原活性。Qi等[37]從中克隆出PDOR編碼基因，轉(zhuǎn)化獲得高效表達(dá)的PDOR，研究了其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)相比于其氧化活力，PDOR的還原活力的作用條件更溫和，最適反應(yīng)pH為7.0，溫度為37 ℃。Qi等[38]還從中克隆到，獲得新型重組PDOR，最適反應(yīng)pH為7.5，溫度為37 ℃，這對(duì)于1,3-PD的最終生成是有利的，對(duì)酶的3D結(jié)構(gòu)分析表明，不同來(lái)源的兩種PDOR均屬于Ⅲ型乙醇脫氫酶。

將進(jìn)行原始菌株中的過(guò)表達(dá)是提高PDOR活力的最直接的一種方法。由于PDOR的酶促反應(yīng)依賴于輔酶NADH[39]，當(dāng)副產(chǎn)物途徑被阻斷時(shí)，這些突變體內(nèi)細(xì)胞的氧化還原力NADH/NAD+較高，因此，進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)基因和，使用這些多余的NADH，以提高1,3-PD產(chǎn)量。Cui等[12]在兩株KG1-3 (只阻斷2,3-丁二醇途徑的突變株) 和KG1-5 (阻斷2,3-BD和乳酸途徑的突變株) 中將基因過(guò)表達(dá)。結(jié)果表明，在菌株KG1-5中，氧化還原平衡力恢復(fù)正常，產(chǎn)量提高明顯，甘油1,3-PD的產(chǎn)量也恢復(fù)到正常水平的60%。

還有學(xué)者將PDOR編碼基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用共轉(zhuǎn)化的方法，達(dá)到提高酶濃度與活力的目的。Yun等[40]從中克隆得到基因，使其在BL21中高效表達(dá)，將轉(zhuǎn)化與混合，采用全細(xì)胞生物催化的方法進(jìn)行甘油到1,3-PD的轉(zhuǎn)化，由于PDOR的催化需要輔酶NADH，因此額外添加了NADH來(lái)實(shí)現(xiàn)還原力的平衡。結(jié)果表明，PDOR的全細(xì)胞生物催化有效提高了1,3-PD的產(chǎn)量，相比于單獨(dú)利用發(fā)酵提高了2倍，1,3-PD的產(chǎn)量為25.88 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.54 g/g甘油。

許多研究人員還在尋找生產(chǎn)1,3-PD自然菌株中原始酶以外的方法來(lái)轉(zhuǎn)化3-HPA。其中一種方法是從其他的菌株中尋找可以催化3-HPA為1,3-PD的酶，通過(guò)代謝工程構(gòu)建異源重組菌株。例如，大腸桿菌中存在一種PDOR的同工酶，被命名為PDORI，由基因編碼，該酶被證實(shí)是與中的PDOR有相同功能的氧化還原酶。許多研究人員研究了該基因，并構(gòu)建了含有該基因的工程菌來(lái)增加1,3-PD的產(chǎn)量。Zhu等[41]構(gòu)建了的重組菌體，將原始菌株中導(dǎo)入基因來(lái)提高酶的濃度。重組突變體最終的1,3-PD濃度達(dá)到67.6 g/L，與原始株相比，產(chǎn)量提高了125.33%，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.62 mol / mol。重組酶活性檢測(cè)表明，相比原始菌株，酶活力提高了10倍。此外，3-HPA濃度與原始菌株相比降低了22.4%。因此，利用基因的過(guò)表達(dá)相關(guān)基因是解決1,3-PD生物生產(chǎn)中中間代謝產(chǎn)物3-HPA對(duì)細(xì)菌的抑制問(wèn)題的一種有效方法。

3.2 構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)

如上所述，NADH/NAD+比較高時(shí)，NADH作為還原當(dāng)量對(duì)1,3-PD的生物合成起著關(guān)鍵的作用，構(gòu)建輔酶再生系統(tǒng)，將有利于1,3-PD的生產(chǎn)。黃志華等[42-43]選取NAD+依賴型的甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH) 為研究對(duì)象，利用基因工程的手段構(gòu)建了含有該基因的重組質(zhì)粒，在中表達(dá)了的甲酸脫氫酶的基因，構(gòu)建了NADH再生系統(tǒng)，對(duì)甘油代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。結(jié)果表明，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵，1,3-PD的產(chǎn)量達(dá)到78.6 g/L，與原始菌株相比，產(chǎn)量提高了12.5 %。

3.3 3-HPA流向其他途徑

減少1,3-PD發(fā)酵中3-HPA濃度的另一種方法是將其部分轉(zhuǎn)化為其他代謝物。例如，中存在一種NAD+依賴型的γ-谷氨酰-γ-氨基丁酸醛脫氫酶(PuuC)，由基因編碼，可以將3-HPA氧化為3-羥基丙酸 (3-HP)，3-HP也是一種重要的化工產(chǎn)品[10]。由于原始菌中的表達(dá)量較少，Ashok等[44]將DSM 2026中的基因過(guò)表達(dá)，PuuC催化3-HPA生成3-HP時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多的NADH，這些NADH也可以用于1,3-PD的合成，達(dá)到了還原當(dāng)量的充分利用。分批補(bǔ)料發(fā)酵中，重組() 菌株產(chǎn)生16.0 g/L 3-HP和16.8 g/L 1,3-PD，經(jīng)過(guò)24 h轉(zhuǎn)化，甘油到1,3-PD的轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.51 mol/mol，轉(zhuǎn)化率較高。這種將3-HPA流向其他途徑的方式不僅降低了3-HPA對(duì)細(xì)胞的毒性，使細(xì)菌代謝正常有序地進(jìn)行，而且為3-HP和1,3-PD的聯(lián)產(chǎn)提供了參考。

4 生物轉(zhuǎn)化中的副產(chǎn)物與應(yīng)對(duì)策略

副產(chǎn)物的形成和維持氧化還原平衡是1,3-PD生產(chǎn)中的又一個(gè)瓶頸。如圖1所示，在甘油的歧化過(guò)程中，除1,3-PD外可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物如乙酸、琥珀酸、乳酸、丁酸等，這些物質(zhì)成為1,3-PD生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物。在甘油氧化分支，甘油經(jīng)幾個(gè)ATP依賴的氧化還原酶催化，轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)。同時(shí)，在糖酵解代謝途徑中，葡萄糖也會(huì)轉(zhuǎn)化為PEP。以上生成的PEP可由丙酮酸激酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸，生成一系列副產(chǎn)物。許多因素可以影響這一過(guò)程，如外部條件和遺傳條件等[45]。因此，改變其中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，這些副產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量都將受到影響。這些副產(chǎn)物的形成會(huì)消耗甘油或葡萄糖中的碳，從而導(dǎo)致流向其他產(chǎn)物的碳減少，使1,3-PD的產(chǎn)量下降[46]。另外，這些副產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有抑制作用。因此，利用基因工程的手段，通過(guò)敲除相關(guān)基因來(lái)降低這些副產(chǎn)物的生成是一個(gè)較好的應(yīng)對(duì)策略。然而，這些途徑可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原力的平衡，因此，在敲除這些相關(guān)基因時(shí)，應(yīng)保持氧化還原電位以滿足目標(biāo)代謝反應(yīng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。要避免不必要的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)需保持氧化還原力的平衡，這對(duì)提高1,3-PD產(chǎn)量也是一個(gè)挑戰(zhàn)。在保證其氧化還原力的前提下，研究者們主要采取以下方法來(lái)降低副產(chǎn)物的形成。

4.1 與DHA或DHAP相關(guān)的基因敲除

GDH是由基因編碼的，需要輔酶NAD+的參與，可將甘油氧化為DHA；DHAK是由基因編碼的，參與催化DHA的磷酸化，生成DHAP。這是甘油氧化分支的第一步。阻斷1,3-PD的生物生產(chǎn)中副產(chǎn)物生成的途徑，最直接的是敲除與DHA和DHAP合成相關(guān)基因。Horng等[47]利用同源重組將中的和基因敲除，命名為TC100，采用的方法是將操縱子中的-基因中插入一段鏈霉素抗性基因，以便后續(xù)重組子的篩選。利用重組的TC100在50 mL三角瓶進(jìn)行1,3-PD的搖瓶發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)表明，在37 ℃下孵育48 h后，相比于野生菌株，TC100的產(chǎn)量增加了1.06倍；副產(chǎn)物如乳酸、2,3-丁二醇、乙醇均未檢出。然而，這一突變菌株與野生菌株相比細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況較差，生 物量少，生產(chǎn)1,3-PD的生產(chǎn)強(qiáng)度低，他們通過(guò)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，并調(diào)整了培養(yǎng)條件來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，獲得了較高的1,3-PD生產(chǎn)強(qiáng)度。

完全敲除甘油歧化的氧化分支來(lái)降低副產(chǎn)物形成方法使還原力NADH降低，導(dǎo)致生物量降低，反過(guò)來(lái)影響了甘油的還原分支，會(huì)對(duì)1,3-PD的生產(chǎn)造成一定影響。這一問(wèn)題可通過(guò)割裂1,3-PD生成途徑和生物量增長(zhǎng)途徑的方式來(lái)解決。Maervoet等[48]研究了的1,3-PD生產(chǎn)過(guò)程，利用基因工程的手段來(lái)構(gòu)建DSM17579 ?，即敲除基因，同時(shí)，利用葡萄糖作為共發(fā)酵底物，保證細(xì)菌主流代謝途徑的正常運(yùn)作，以增加生物量。最終使1,3-PD產(chǎn)量提高了1.5倍。

4.2 與丙酮酸還原相關(guān)基因的敲除

乳酸是丙酮酸的還原產(chǎn)物之一，每生成一個(gè)單位的乳酸，需要一個(gè)單位的NADH。它是在甘油歧化途徑中從丙酮酸出發(fā)碳分流的主要產(chǎn)物，屬于1,3-PD生產(chǎn)中的副產(chǎn)物。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，乳酸在指數(shù)期后期累積，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，許多研究人員通過(guò)敲除乳酸脫氫酶基因，獲得乳酸缺陷突變體以抑制乳酸的合成，對(duì)1,3-PD發(fā)酵具有重要意義。Durgapal等[1]對(duì)J2B利用甘油產(chǎn)1,3-PD的能力進(jìn)行了研究，他們構(gòu)建了一個(gè)基因缺失突變體，比較野生型菌株和?突變株在不同培養(yǎng)條件、不同培養(yǎng)模式下 (分批或補(bǔ)料培養(yǎng)) 的生長(zhǎng)狀況以及1,3-PD生成水平。當(dāng)?以補(bǔ)料培養(yǎng)方式發(fā)酵甘油時(shí)，1,3-PD的產(chǎn)量為58 g/L，產(chǎn)率為0.35 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.3 g/(L·h)。碳流分析表明，?突變株產(chǎn)生極其微量的乳酸，2,3-丁二醇 (2,3-BD) 比野生株產(chǎn)量高，產(chǎn)量為26.6 g/L，成為主要副產(chǎn)物。

2,3-BD也是從丙酮酸出發(fā)生成的另一個(gè)產(chǎn)物，成為甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD中的又一個(gè)主要副產(chǎn)品。2,3-BD也是二醇，與1,3-PD有相似的沸點(diǎn)，且都與水互溶。因此，2,3-PD的這一性質(zhì)導(dǎo)致了1,3-PD生產(chǎn)與純化中一個(gè)棘手的問(wèn)題[49]，使獲得純度較高的1,3-PD成本大大增加[49-50]。通過(guò)敲 除合成2,3-丁二醇的編碼基因，阻斷其合成途 徑，可以有效解決這一問(wèn)題。Kumar等[2]在得到J2B ?突變株后，為了改善2,3-BD的問(wèn)題，進(jìn)一步敲除了2,3-BD代謝相關(guān)的基因，包括整個(gè)bud操縱子上的、、和基因。結(jié)果表明，這種敲除完全阻斷了2,3-BD的合成，不過(guò)1,3-PD的產(chǎn)量也下降了。他們認(rèn)為，丙酮酸的大量積累是導(dǎo)致其產(chǎn)量下降的主要原因，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢。由于丙酮酸的積累，觸發(fā)負(fù)反饋機(jī)制，導(dǎo)致上游產(chǎn)物如二羥基丙酮、3-磷酸甘油醛等的積累。GDHt活力測(cè)定表明，3-磷酸甘油醛抑制了該酶活力從而降低了1,3-PD的產(chǎn)量。也有其他學(xué)者研究了其他2,3-BD相關(guān)基因的敲除，如基因，該基因編碼乙酰乳酸合酶，如圖1所示，α-乙酰乳酸是2,3-BD的中間產(chǎn)物之一。Lee等[51]將中的基因敲除后，將異源的(編碼丙酮酸脫羧化酶) 和(編碼乙醛脫氫酶) 基因?qū)?，減少了2,3-BD的積累，1,3-PD的產(chǎn)量也有一定提高。

4.3 與乙酰CoA還原相關(guān)的基因敲除

丙酮酸還原后，除了一部分流向生成乳酸和丙酮酸，還有大部分流入乙酰CoA，乙酰CoA是丙酮酸代謝過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，由丙酮酸脫氫酶催化，之后生成了更多的次級(jí)代謝物，如乙酸、乙醇和丁酸等。這些代謝物或多或少都對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，成為1,3-PD生物合成工業(yè)中的副產(chǎn)品[52]。目前，很多學(xué)者采取基因敲除的方法構(gòu)建缺失菌株以減少這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生，取得了較好的結(jié)果。

乙酸是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物之一。在乙酰CoA的代謝物中，乙酸對(duì)細(xì)菌的毒性最強(qiáng)[53]。因此，乙酸合成途徑的阻斷是基因工程改造的最重要的目標(biāo)。Lin等[54]敲除了中乙酸合成兩條途徑中相關(guān)酶的編碼基因、和，這些基因分別編碼丙酮酸氧化酶、磷酸轉(zhuǎn)乙?；负鸵宜峒っ福⒀芯炕蛉笔Ь陮?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和1,3-PD生產(chǎn)的影響。分批發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的最終產(chǎn)量達(dá)到76.8 g/L，與相同發(fā)酵條件下野生株的產(chǎn)量提高了15%。這些基因的缺失極大降低了乙酸的合成，使更多的碳流向TCA等代謝途徑，不但增加了生物量，也提高了1,3-PD的產(chǎn)量。乙醇是1,3-PD形成的另一種主要產(chǎn)物，乙酰CoA在乙醛脫氫酶 (由基因編碼) 催化下生成乙醛；之后在乙醇脫氫酶 (由基因編碼) 催化下，乙醛還原成乙醇。這一過(guò)程需要消耗甘油還原途徑中產(chǎn)生的NADH，因此許多學(xué)者同時(shí)阻斷乳酸和乙醇的合成途徑來(lái)提高1,3-PD產(chǎn)量。Chen等[55]采用λ Red重組技術(shù)對(duì)進(jìn)行改造，獲得2-1 ?、2-1 ?和2-1 ??突變株。分批發(fā)酵結(jié)果表明，以上3株重組菌的副產(chǎn) 物濃度與原始菌株相比顯著降低，1,3-PD的產(chǎn)量 也分別提高至85.7、82.5、87.5 g/L，而原始菌株提高至78.8 g/L。

表1 不同基因工程菌株生產(chǎn)1,3-PD情況比較表

表2 不同方法改造K. pneumoniae來(lái)源關(guān)鍵酶的酶學(xué)數(shù)據(jù)

5 展望

利用生物柴油的副產(chǎn)物粗甘油進(jìn)行1,3-PD的生物合成符合可持續(xù)發(fā)展的趨勢(shì)?；蚬こ毯蜕锛夹g(shù)的發(fā)展可有效解決1,3-PD生產(chǎn)中的局限，但是基因工程菌的潛力還有待發(fā)掘，具有較廣闊的研究應(yīng)用前景。首先，利用宏基因組中獲得的新型相關(guān)基因構(gòu)建高效基因工程菌，可進(jìn)一步解決相關(guān)抑制問(wèn)題。其次，上述提到的方法聯(lián)合使用可以達(dá)到綜合改善微生物特征的目的。此外，結(jié)合一些化學(xué)誘變、ARTP誘變、genome shuffling等育種技術(shù)，也可以最大限度地提高菌株耐受性從而提高1,3-PD的產(chǎn)量。再次采用更多理性、非理性或半理性的方法將1,3-PD發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行改造優(yōu)化，可提高酶的催化活性，從而提高產(chǎn)量。另外，還可從發(fā)酵工藝入手，通過(guò)連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵降低底物和產(chǎn)物對(duì)生產(chǎn)菌株的抑制作用，提高1,3-丙二醇的產(chǎn)量。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Bottlenecks and modification strategies of 1,3-propanediol biosynthesis from glycerol

Miaomiao Yang*, Junhua Yun*, Huanhuan Zhang, Guoyan Zhang, Hossain Zabed, and Xianghui Qi

School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China

Crude glycerol is the main by-product of biodiesel production. A few microorganisms can transfer crude glycerol to 1,3-propanediol (1,3-PD) that is an important chemical material. There exist many limitations such as substrate inhibition, product inhibition when wild strains are used in 1,3-PD biosynthesis. In this review, based on the microbial transformation of 1,3-propanediol from glycerol and its limitations, some strategies using genetic engineering such as knockout or gene overexpression were summarized. The latest research progresses in biosynthesis of 1,3-propanediol from glycerol by genetically engineered strains are discussed.

glycerol, 1,3-propanediol, bioconversion, biosynthesis, genetic engineering

December 25, 2017;

February 28, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31571806), National Key Research and Development Program (No. 2017YFC1600806), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2017M621657), High-level Talents Project of Six Talent Peaks in Jiangsu Province (No. SWYY-018).

Xianghui Qi. Tel: +86-511-88797059; Fax: +86-511-88780201; E-mail: qxh@ujs.edu.cn

*These authors contributed equally to this work.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31571806)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No. 2017YFC1600806)，中國(guó)博士后基金 (No. 2017M621657)，江蘇省“六大人才高峰”項(xiàng)目 (No. SWYY-018) 資助。

2018-03-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180326.0836.001.html

10.13345/j.cjb.170516