劉鵬飛，陸啟蒙，胡雪芹，侯學(xué)文，張洪斌

?

α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)純化、酶學(xué)性質(zhì)及其催化應(yīng)用

劉鵬飛，陸啟蒙，胡雪芹，侯學(xué)文，張洪斌

合肥工業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009

金城. 2018酶工程專刊序言. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶(α-amino acid ester acyltransferase，AET) 能夠催化底物L(fēng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (L-alanyl-L-glutamine，丙谷二肽)。利用重組大腸桿菌saet-QC01表達(dá) α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶，對其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過Ni-NTA親和層析法分離純化重組蛋白，并對其酶學(xué)性質(zhì)、催化應(yīng)用進(jìn)行了研究。適合酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件：溫度20 ℃，誘導(dǎo)階段 (600=2.0?2.5)，IPTG濃度0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時間12 h。α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度27 ℃，最適pH 8.5，在pH 7.0?8.0很穩(wěn)定，在酸性條件下相對穩(wěn)定，低濃度的Co2+、低濃度的EDTA對酶活有促進(jìn)作用。在底物濃度丙氨酸甲酯鹽酸鹽600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L，丙谷二肽的產(chǎn)量達(dá)到78.2 g/L，生產(chǎn)速率達(dá)到1.955 g/(L·min)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到75.0%。α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶具有良好的酸堿耐受性，催化效率高的優(yōu)良特性，在工業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。

α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶，丙谷二肽，表達(dá)條件，酶學(xué)性質(zhì)，催化條件

谷氨酰胺 (Gln) 因?yàn)樵跈C(jī)體的新陳代謝方面扮演著重要角色，近年來在預(yù)防和治療某些疾病方面受到重要關(guān)注。谷氨酰胺雖然是非必需氨基酸，但在機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，對維護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的完整性具有不可替代的作用；在機(jī)體受創(chuàng)、患敗血癥、化療放療中，自身合成的谷氨酰胺不能滿足需求，使其成為一種條件必需氨基酸[1-2]。但谷氨酰胺水溶性差，單體在酸性條件下不穩(wěn)定，在加熱條件下易生成有毒的焦谷氨酸[3-4]，限制了其在臨床上的應(yīng)用。而研究發(fā)現(xiàn)肽中谷氨酰胺的酰胺基比游離谷氨酰胺中的酰胺基要穩(wěn)定[5]，而且谷氨酰胺寡肽作為谷氨酰胺代用品具有突出的功效性和安全性。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 (L-alanyl-L-glutamine，丙谷二肽) 性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度高[6-7]，在體內(nèi)數(shù)分鐘即分解出谷氨酰胺，因其安全性和有效性[8]常作為注射液的主要營養(yǎng)組成成分用于術(shù)后患者的康復(fù)[9]。近年來，該肽受到國內(nèi)外的密切關(guān)注。

目前，工業(yè)生產(chǎn)丙谷二肽的方法主要為化學(xué)法，但化學(xué)法反應(yīng)步驟繁瑣，路線較長，中間環(huán)節(jié)多，需要使用有毒的化學(xué)試劑，易生成副產(chǎn)物，后期分離純化困難，合成條件苛刻，成本高昂[10-11]，給工業(yè)生產(chǎn)帶來諸多困難。

隨著微生物技術(shù)在工業(yè)上的不斷發(fā)展，利用微生物酶法合成丙谷二肽也成為研究熱點(diǎn)。Tabata 等[12-16]發(fā)現(xiàn)在168中ywfE 基因編碼一種L-氨基酸連接酶，該酶以游離氨基酸為底物合成二肽，可催化L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽，副產(chǎn)物較少，但需要額外添加ATP，丙谷二肽的產(chǎn)率低且積累率低，而且L-氨基酸連接酶過表達(dá)對細(xì)菌生長帶來負(fù)面影響。Yokozeki等[17]篩選到一株能合成α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶 (EAET) 的短穩(wěn)桿菌，該酶能以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽 (L-Ala-OMe·HCl) 和L-谷氨酰胺為底物高效合成丙谷二肽。Hirao等[18]從鞘氨醇桿菌里得到了活性更高的α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶 (SAET)，具有更高的合成丙谷二肽的能力。因此，文中利用重組大腸桿菌表達(dá)α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶，并對其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過Ni-NTA親和層析法對粗酶液進(jìn)行分離純化，以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物在重組酶的作用下合成丙谷二肽，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究并對催化條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，為工業(yè)生產(chǎn)丙谷二肽提供了理論基礎(chǔ)，也為其他生產(chǎn)丙谷二肽的技術(shù)改進(jìn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

丙谷二肽 (純度>99%)、L-谷氨酰胺 (純度>99%)、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽 (純度>99%) 均由合肥川迪醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株

重組α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶大腸桿菌saet-QC01為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；本實(shí)驗(yàn)室將pET28a質(zhì)粒與α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-SAET，然后轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，成功篩選出構(gòu)建成功的菌株，并將菌株命名為saet-QC01。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，(固體添加1.5%的瓊脂粉)。

S培養(yǎng)基：甘油5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物10 g/L，無水MgSO41 g/L，pH 6.3。

1.4 saet-QC01的初始培養(yǎng)條件

將重組α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌saet-QC01以1% (體積分?jǐn)?shù)) 的接種量接種至20 mL含卡那霉素 (100 μg/mL) 的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h，再按1% (體積分?jǐn)?shù)) 接種量轉(zhuǎn)接至50 mL含卡那霉素 (100 μg/mL) 的S液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)至600=2.0 時添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.6 mmol/L，25 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)條件優(yōu)化。誘導(dǎo)結(jié)束后發(fā)酵液以8 000×離心15 min后去上清，保留菌體。

1.5 酶液制備與純化

50 mL發(fā)酵液的離心后的菌體用10 mL的硼酸緩沖液 (pH 8.5) 重懸，超聲破碎 (參數(shù)為破碎 2 s，間隔3 s，破碎時間15 min，破碎功率15 W)，破碎結(jié)束后8 000×離心15 min，取上清液即為粗酶液。將粗酶液經(jīng)鎳柱純化，純化步驟經(jīng)過裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫，收集洗脫液。

1.6 酶活測定

取0.1 mL酶液，加入1 mL含200 mmol/L谷氨酰胺、200 mmol/L 丙氨酸甲酯鹽酸鹽的底物溶液(pH 8.5)，混勻后在25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，加入等體積1.7% (/) H3PO4溶液終止反應(yīng)，經(jīng)0.22 μm的濾頭過濾后，按1.7所述測定丙谷二肽的濃度，一個酶活單位定義為1 mL底物在1 h內(nèi)生成0.1 mg產(chǎn)物所需的酶量。

1.7 丙谷二肽檢測

HPLC檢測：采用高效液相色譜法檢測丙谷二肽的濃度，色譜條件：色譜柱為TSKgel Amide-80 HR (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為：0.05 mol/L KH2PO4(pH 4.0)：乙腈=35∶65；流速為1 mL/min，檢測波長214 nm。

1.8 表達(dá)條件優(yōu)化

對不同的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括誘導(dǎo)溫度 (15、20、25、30、35 ℃)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)，誘導(dǎo)時間 (6、12、18、24、30 h) 和加入TPTG時的初始菌體濃度600(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)。

1.9 酶學(xué)性質(zhì)

最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性：在pH 8.5的硼酸緩沖液中，將酶液置于不同溫度下 (23、25、27、29、31 ℃) 測定酶活，最高以100%計(jì)，計(jì)算相對活力。將酶液置于不同溫度 (25、30、35、40、45、50 ℃)下處理30 min，在最適溫度下測定相應(yīng)的酶活，最高以100%計(jì)，計(jì)算相對活力，考察熱穩(wěn)定性。

最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性：將酶液置于不同pH緩沖液中于25 ℃測定酶活力，酶活最高以100%計(jì)，計(jì)算相對活力。將酶液置于各pH下，4 ℃孵育12 h，在25 ℃下測定相應(yīng)的酶活，最高以100%計(jì)，計(jì)算相對活力，考察pH穩(wěn)定性。

金屬離子及化合物對酶活力的影響：用硼酸緩沖液 (pH 8.5) 配制100 mmol/L的MgCl2、CaCl2、MnSO4、CoCl2、NiCl2、FeCl3、SDS、EDTA溶液，稀釋，使其在酶促反應(yīng)中終濃度分別為1、5、10 mmol/L，測定酶活力，以未加入上述試劑的酶液為對照100%，計(jì)算相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)條件優(yōu)化

saet-QC01作為α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的合成菌株，但其表達(dá)條件需要優(yōu)化。首先，在15?35 ℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行saet-QC01中蛋白的誘導(dǎo)，結(jié)果如圖1所示，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的酶活最高，20 ℃是最適合saet-QC01誘導(dǎo)的溫度。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對酶的表達(dá)也產(chǎn)生影響，結(jié)果如圖2所示，IPTG終濃度為0.6 mmol/L時，誘導(dǎo)表達(dá)的酶活最高。研究saet-QC01生長期對酶表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)初始菌體濃度600為2.0?2.5時酶活最高，結(jié)合saet-QC01生長曲線，此時在大腸桿菌的生長對數(shù)期的中期，表明當(dāng)在大腸桿菌生長曲線的中期對數(shù)期時最適宜加IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時間對酶活的影響不顯著，如圖4所示，但在誘導(dǎo)12 h時，酶活最高，隨時間的延長，酶活有所降低，誘導(dǎo)時間12 h為宜。

圖1 誘導(dǎo)溫度對SAET表達(dá)的影響

圖2 IPTG濃度對SAET表達(dá)的影響

圖3 OD600對SAET表達(dá)的影響

圖4 誘導(dǎo)時間對SAET表達(dá)的影響

2.2 α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

將發(fā)酵后的菌體破碎后收集上清并進(jìn)行SDS-PAGE，再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖5所示，saet-QC01菌體破碎上清液中出現(xiàn)約68 kDa的條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)SDS-PAGE的分子量68 kDa一致[19]，但陰性對照的pET28a空載的破碎上清液也出現(xiàn)68 kDa的條帶，則不能證明該條帶蛋白是由目的基因表達(dá)而來，所以將saet-QC01菌體破碎上清液采用Ni-NTA親和層析方法分離純化，經(jīng)不同濃度的咪唑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色，如圖6所示，在經(jīng)80 mmol/L咪唑洗脫的洗脫液中出現(xiàn)分子量約為68 kDa的單一條帶，說明該蛋白是由目的基因表達(dá)而來，與文獻(xiàn)報(bào)道α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶經(jīng)SDS-PAGE的分子量68 kDa一致[19]。

圖5 重組α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶SDS-PAGE分析

圖6 純化α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶SDS-PAGE

考察最適反應(yīng)溫度對催化反應(yīng)極為重要，由圖7所示，α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的最佳催化溫度為27 ℃。由圖8所示，35 ℃處理30 min，酶活力保持在25 ℃時酶活的80%以上，45 ℃處理30 min后酶基本已經(jīng)失活。上述結(jié)果表明，該酶的作用溫度范圍不是很廣泛，對熱也較為敏感，無法長時間放置在高溫的過程中。

圖7 溫度對SAET活力的影響

圖8 溫度對SAET穩(wěn)定性的影響

反應(yīng)的pH值對酶的穩(wěn)定性有重要影響，但酶的最適穩(wěn)定pH不一定是最佳反應(yīng)pH，考察最佳反應(yīng)pH值也很重要。由圖9所示，在堿性范圍內(nèi)，α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的活性先隨pH值的升高而升高，在pH 8.5時其活性最高，pH 8.5是α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶的最佳催化pH值。由圖10所示，α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶在pH 7.0?8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好，孵育12 h，酶活力仍能保留原來的90%以上。

金屬離子及化合物對α氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶活力的影響如表1所示。低濃度的Co2+和低濃度的EDTA對該酶有輕微的促進(jìn)作用，低濃度的Co2+將酶活力提高5.35%，低濃度的EDTA將酶活力提高3.33%；高濃度的Fe3+、Ni2+、SDS對該酶有明顯的抑制作用，高濃度的SDS使該酶喪失酶活性；高濃度Mn2+對該酶有輕微的抑制作用；Ca2+、Mg2+對該酶無明顯影響。

圖9 pH對SAET活力的影響

圖10 pH對SAET穩(wěn)定性的影響

表1 金屬離子及化合物對SAET活力的影響

2.3 α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶催化條件優(yōu)化

反應(yīng)底物的配比對產(chǎn)物的生成有重要影響，固定丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度為250 mmol/L，谷氨酰胺與其的比例為A：0.6、B：0.8、C：1.0、D：1.2，在27 ℃、pH 8.5下反應(yīng)1 h，結(jié)果如圖11所示，丙谷二肽的產(chǎn)量隨著底物谷氨酰胺的濃度的增加而增大，且相對于底物谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率依次為19.5%、19%、15.7%和13.2%，轉(zhuǎn)化率是降低的，但當(dāng)比例達(dá)到0.8后，產(chǎn)物的產(chǎn)量增加有限，但轉(zhuǎn)化率卻降低明顯，所以當(dāng)丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度為250 mmol/L，谷氨酰胺濃度為200 mmol/L，即比例為0.8時應(yīng)為底物的最佳濃度比。

丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度為100、200、300、400、500、600 mmol/L，谷氨酰胺和丙氨酸甲酯鹽酸鹽的添加比例為0.8，在優(yōu)化后的最佳條件下反應(yīng)，丙谷二肽的產(chǎn)量如圖12所示。當(dāng)反應(yīng)40 min時，丙谷二肽的產(chǎn)量趨于平衡。隨著丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度從100 mmol/L增加到600 mmol/L，丙谷二肽的量分別為15.1、29.2、42.3、56.2、69.5、78.2 g/L，相對于谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為86.7%、84.0%、81.1%、80.9%、80.0%和75.0%。

圖11 底物的配比對催化反應(yīng)的影響

圖12 底物濃度對催化反應(yīng)的影響

3 討論

丙谷二肽作為谷氨酰胺的替代物，應(yīng)用前景廣泛，但目前在丙谷二肽的生產(chǎn)方式上存在短板，生產(chǎn)過程復(fù)雜，成本高昂，α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的出現(xiàn)為丙谷二肽的合成帶來了新的曙光。文中首先對重組大腸桿菌saet-QC01的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，誘導(dǎo)溫度在20 ℃和25 ℃時，表達(dá)的酶活差別不大，但誘導(dǎo)溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速度過快，多肽鏈不能正確折疊，使得疏水基因暴露在外容易形成包涵體，因此當(dāng)酶活相似時，選取最后的誘導(dǎo)溫度為20 ℃[20-21]；IPTG濃度太低時蛋白的表達(dá)量低，酶活較小，而IPTG濃度過高反而會抑制蛋白的表達(dá)，而且IPTG有細(xì)胞毒性，不利于菌體生長[22-23]，選取IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L；加入IPTG時，600在2.0–2.5時，酶活的大小相差不大，結(jié)合該重組大腸桿菌的生長曲線，當(dāng)600達(dá)到2.0–2.5時，此時為該重組菌的對數(shù)生長期的中期階段，在此時，菌體活力強(qiáng)，生長能力旺盛，酶的表達(dá)能力高，所以誘導(dǎo)的初始菌濃度600為2.0–2.5時最佳；一般誘導(dǎo)時間越長，目的蛋白的表達(dá)量越高，但誘導(dǎo)時間過長，誘導(dǎo)產(chǎn)生的氨基酸反而會抑制目的蛋白的合成[24]，當(dāng)誘導(dǎo)時間在12 h時酶活力最高；所以最終的優(yōu)化結(jié)果為：最佳的誘導(dǎo)溫度20 ℃，加入IPTG時初始菌濃度600為2.0–2.5，IPTG濃度0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時間12 h；然后對α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，該酶的最佳反應(yīng)溫度為27 ℃，反應(yīng)pH 8.5，在pH 7.0–8.0很穩(wěn)定，在酸性條件下相對穩(wěn)定，低濃度的Co2+、低濃度的EDTA對酶活有促進(jìn)作用；最后對該酶催化合成丙谷二肽的催化條件進(jìn)行了研究，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)丙谷二肽的高效合成，即溫度為27 ℃，pH 8.5，谷氨酰胺和丙氨酸甲酯鹽酸鹽的添加比例為0.8，當(dāng)丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度為600 mmol/L、谷氨酰胺的濃度為 480 mmol/L時，反應(yīng)40 min時丙谷二肽的量為78.2 g/L，丙谷二肽的生產(chǎn)速率達(dá)到1.955 g/(L·min)，相對于谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為75.0%，達(dá)到國際的最佳水平[25]。

在提高丙谷二肽的轉(zhuǎn)化率和積累量上，可以對反應(yīng)體系中底物采取流加的方式進(jìn)行研究，可以改變流加濃度、流加速度、流加量來實(shí)現(xiàn)丙谷二肽的優(yōu)化生產(chǎn)。另外還可以對α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，對其基因序列實(shí)行定點(diǎn)突變的方式，篩選有效的突變體，增加酶的穩(wěn)定性和催化效率，向提高丙谷二肽合成效率的方向推進(jìn)。

[1] Tapiero H, Mathé G, Couvreur P, et al. II. Glutamine and glutamate. Biomed Pharmacother, 2002, 56(9): 446–457.

[2] Wernerman J. Suggestion for present and future use of parenteral glutamine. Clin Nut Suppl, 2004, 1(1): 37–42.

[3] Fürst P. New developments in glutamine delivery. J Nut, 2001, 131(9): 2562S–2568S.

[4] Lacey JM, Wilmore DW. Is glutamine a conditionally essential amino acid. Nut Rev, 1990, 48(8): 297–309.

[5] Abumrad NN, Morse EL, Lochs A, et al. Possible sources of Gln for Parenteral nutrition. Am J Physiol, 1989, 257(2 Pt 1): E228–E234.

[6] Tritsch GL, Moore GE. Spontaneous decomposition of glutamine in cell culture media. Exp Cell Res, 1962, 28(2): 360–364.

[7] Yagasaki M, Hashimoto SI. Synthesis and application of dipeptides; current status and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81(1): 13–22.

[8] Fürst P, Pogan K, Stehle P. Glutamine dipeptides in clinical nutrition. Nutrition, 1997, 13(7/8): 731–737.

[9] Fürst P, Stehle P. Glutamine supplemented nutrition in clinical practice--use of glutamine-containing dipeptides. Infusionstherapie Und Transfusionsmedizin, 1995, 22(5): 317–324.

[10] Liu SX, Yang YH, Liu XW, et al. Direct amidation of amino acid derivatives catalyzed by arylboronic acids: applications in dipeptide synthesis. Eur J Org Chem, 2013, 2013(25): 5692–5700.

[11] Nilsson BL, Soellner MB, Raines RT. Chemical Synthesis of Proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 2005, 34(19): 91–118.

[12] Steinborn G, Hajirezaei MJ, Hofemeister J.genes for recombinant bacilysin and anticapsin production inhost strains. Arch Microbiol, 2005, 183(2): 71–79.

[13] Tabata K, Ikeda H, Hashimoto S.incodes for a novel enzyme, L-amino acid ligase. J Bacteriol, 2005, 187(15): 5195–5202.

[14] Tabata K, Hashimoto SI. Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineeredstrain expressing L-amino acid alpha-ligase. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(20): 6378–6385.

[15] Kino K, Nakazawa Y, Yagasaki M. Dipeptide synthesis by L-amino acid ligase from. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 371(3): 536–540.

[16] Hashimoto SI, Tabata K. Microorganisms producing dipeptides and process for producing dipeptide using the microorganisms: US, US20100120126. 2010-05-13.

[17] Yokozeki K, Hara S. A novel and efficient enzymatic method for the production of peptides from unprotected starting materials. J Biotechnol, 2005, 115(2): 211–220.

[18] Hirao Y, Mihara Y, Kira I, et al. Enzymatic production of L-alanyl-L-glutamine by recombinantexpressing α-amino acid ester acyltransferasefrom. Biosci Biotechnol Biochem, 2013, 77(3): 618–623.

[19] Abe I, Hara S, Yokozeki K. Gene cloning and characterization of α-amino acid ester acyl transferase inATCC14234 andAJ2458. Biosci Biotechnol Biochem, 2011, 75(11): 2087–2092.

[20] Liu M, Sun Y, Yang YK, et al. Construction of chimeric single-chain antibody efficient soluble expression inand optimization of fermentation conditions. J Biol, 2016, 33(6): 1–6 (in Chinese). 劉萌, 孫楊, 楊艷坤, 等. 人-鼠嵌合單鏈抗體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)和發(fā)酵條件優(yōu)化. 生物學(xué)雜志, 2016, 33(6): 1–6.

[21] Corrales-Garcia L, Ortiz E, Casta?eda-Delgado J, et al. Bacterial expression and antibiotic activities of recombinant variants of human β-defensins on pathogenic bacteria and. Prot Express Purific, 2013, 89(1): 33–43

[22] Lange C, Rudolph R. Suppression of protein aggregation by L-arginine. Curr Pharmaceut Biotechnol, 2009, 10(4): 408–414.

[23] De Araujo ED, Geletu M, Gunning PT. Strategies for over-expression and purification of recombinant full length STAT5B in. Prot Express Purificat, 2017, 129: 1–8.

[24] San-Miguel T, Pérez-Bermúdez P, Gavidia I. Production of soluble eukaryotic recombinant proteins inis favoured in early log-phase cultures induced at low temperature. Springerplus, 2013, 2: 89.

[25] Li YM, Yuan WJ, Gao JQ, et al. Production of L-alanyl- L-glutamine by recyclingexpressing α-amino acid ester acyltransferase. Bioresour Technol, 2017, 245: 1603–1609.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression, purification, characterization and application of α-amino acid ester acyltransferase from recombinant

Pengfei Liu, Qimeng Lu, Xueqin Hu, Xuewen Hou, and Hongbin Zhang

School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei230009, Anhui, China

α-Amino acid ester acyltransferase (Aet) catalyzes the L-alanyl-L-glutamine forming reaction from L-alaine methylester hydrochloride and L-glutamine. In this study, the recombinantsaet-QC01 was used to express the α-amino acid acyltransferase, and its expression conditions were optimized. The recombinant protein was separated and purified by Ni-NTA affinity chromatography, and its enzymatic properties and catalytic applications were studied. The induction conditions suitable for enzyme production optimized were as follows: The temperature was 20 ℃, the induction stage (600=2.0?2.5), IPTG concentration was 0.6 mmol/L, induction time was 12 h. The optimal reaction conditions of α-amino acid acyltransferase were 27 ℃, pH 8.5, it was most stable between pH 7.0 and 8.0 and relatively stable in an acidic environment, and low concentration of Co2+or EDTA could promote the enzyme activity. Under optimal reaction conditions, 600 mmol/L of L-alaine methylester hydrochloride and 480 mmol/L of L-glutamine, the yield of L-alanyl-L-glutamine reached 78.2 g/L and productivity of 1.955 g/L/min, the conversion rate reached 75.0%. α-Amino acid ester acyltransferase has excellent acid-basei resistance, high catalytic efficiency. These characteristics suggest its application prospects in the industrial production.

α-amino acid ester acyltransferase, L-alanyl-L-glutamine, expression conditions, characterization, catalysis conditions

January 9, 2018;

April 23, 2018

College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program of Hefei University of Technology (No. 2017CXCY478), Special Fund for Independent Innovation Program of Anhui Province, China (Qiushi Program of Hefei University of Technology, No. 2013AKKG0391).

Hongbin Zhang. Tel: +86-551-62901968; E-mail: zhb5678@163.com

10.13345/j.cjb.180017

合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2017CXCY478)，安徽省自主創(chuàng)新專項(xiàng)“秋實(shí)計(jì)劃” (No. 2013AKKG0391) 資助。