孫雪娃，何超，方澤民，肖亞中

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云芝NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶在大腸桿菌中表達(dá)及酶學(xué)特性分析

孫雪娃1,2,3，何超1,2,3，方澤民1,2,3，肖亞中1,2,3

1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601 2 現(xiàn)代生物制造安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601 3 安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230601

金城. 2018酶工程專(zhuān)刊序言. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

云芝具有很強(qiáng)的環(huán)境有機(jī)污染物降解能力，其煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細(xì)胞色素P450還原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR) 為細(xì)胞色素P450酶 (Cytochrome P450s，CYPs) 提供電子，參與有機(jī)污染物的降解過(guò)程。序列分析顯示，云芝基因組擁有1個(gè)潛在CPR序列和多個(gè)潛在CYP序列。為深入研究云芝CPR參與細(xì)胞降解有機(jī)污染物的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了云芝CPR在大腸桿菌中異源表達(dá)和酶學(xué)特性分析。結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，去除預(yù)測(cè)的N端膜錨定區(qū)域 (氨基酸殘基1–24) 的CPR蛋白 (CPRΔ24) 可在重組菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，且表達(dá)蛋白的分子量與理論值 (78 kDa) 一致。鎳離子親和層析和分子篩層析純化后測(cè)得其比活性為5.82 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，重組CPRΔ24的最適溫度和pH分別為35 ℃和8.0，并對(duì)一些金屬離子及有機(jī)溶劑具有不同程度的耐受性。酶在35 ℃、pH 8.0反應(yīng)條件下對(duì)NADPH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和cat分別為19.7 μmol/L、3.31/s；對(duì)底物細(xì)胞色素c的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和cat分別為25.9 μmol/L、10.2/s。以上研究為探究云芝CPR在環(huán)境有機(jī)污染物降解途徑中的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

云芝，NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶，大腸桿菌，異源表達(dá)，酶學(xué)特性

白腐真菌能夠降解許多難降解有機(jī)污染物，除了其胞外木質(zhì)素降解酶系，其胞內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶系 (Cytochrome P450s，CYPs) 的降解功能也越來(lái)越引起人們的關(guān)注。白腐真菌可以依賴CYP酶系脫毒和降解環(huán)境中的各種外源化合物[1-2]，如多環(huán)芳烴、酚類(lèi)、固醇類(lèi)和烷烴等化合物。云芝是白腐真菌的一種，能降解多種農(nóng)藥[3]、廢水中的藥物殘留[4-5]以及其他環(huán)境污染物[6-7]，其CYP系統(tǒng)同樣參與這些污染物的降解[4,6-7]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細(xì)胞色素P450還原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR) 是一類(lèi)以FMN (黃素單核苷酸) 和FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸) 為輔基的氧化還原酶，是CYP系統(tǒng)中的重要組成部分。CPR從電子供體NADPH獲得電子之后傳遞給CYPs，而后CYPs才能與底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，發(fā)揮代謝活性。CPR是CYP的主要電子供體，與CYP的電子傳遞反應(yīng)是CYP氧化還原反應(yīng)的限速步驟[1]。真核細(xì)胞的CPR通常錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上而其催化活性中心位于胞質(zhì)一側(cè)。CPR從N端到C端包括N端膜錨定區(qū)、FMN結(jié)合域、中間連接域、FAD和NADPH結(jié)合域。連接域調(diào)節(jié)兩個(gè)黃素輔因子正確的空間構(gòu)象，使其有效傳遞電子[8-9]。CPR作為雙黃素還原酶，對(duì)底物提供電子，使其參與氧化還原反應(yīng)，其底物包括細(xì)胞色素c、微粒體CYPs、細(xì)胞色素b5氧化還原酶、血紅素氧化酶等[10]。

基因組序列分析表明，模式菌黃孢原毛平革菌有149個(gè)和1個(gè)[2,11]。釀酒酵母只有3個(gè)和1個(gè)[12]。云芝中目前也只鑒定出一個(gè)[13]，而有多個(gè)[14]。一些受到外來(lái)化合物的刺激會(huì)上調(diào)表達(dá)[14]，表明云芝化學(xué)壓力響應(yīng)系統(tǒng)參與異生物的代謝。另一方面，的mRNA水平在有無(wú)化學(xué)壓力的細(xì)胞中幾乎不變，表明組成型表達(dá)，該CPR對(duì)CYP的專(zhuān)一性要求可能不高，可以對(duì)一系列的CYPs起到提供電子的作用，也可能支持來(lái)源于近源物種的CYP電子傳遞途徑。

一個(gè)CPR如何驅(qū)動(dòng)那么多CYPs和其他類(lèi)型的底物參與氧化還原反應(yīng)是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。已有的研究發(fā)現(xiàn)，CPR和CYPs主要通過(guò)靜電力相互作用[15-16]。電子從FMN轉(zhuǎn)移到CYP的血紅素的過(guò)程中，CPR經(jīng)歷大的構(gòu)象變化，使FMN輔因子暴露在溶劑中[9,17]。有研究推測(cè)一些膜上的CYPs在一個(gè)CPR分子周?chē)Y(jié)成簇，CPR在不同CYPs分子間穿梭，與CYPs接觸反應(yīng)很 快[18-19]。磷脂雙分子層也會(huì)影響CPR和CYPs的相互作用，它可能通過(guò)和CPR正電荷區(qū)域的弱相互作用而調(diào)節(jié)CPR的還原電勢(shì)[20]。目前，對(duì)CPR和不同CYPs之間相互作用機(jī)制的研究還在發(fā)展階段[21]。

為了體外研究CPR和各種底物之間的相互作用，以及構(gòu)建CYP生物反應(yīng)酶系，需對(duì)CPR進(jìn)行單獨(dú)表達(dá)和純化。目前已有一些關(guān)于CPR在大腸桿菌中異源表達(dá)和功能鑒定的報(bào)道[22-24]。為利于CPR在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效可溶性表達(dá)，通常的策略是對(duì)其N(xiāo)端膜結(jié)合的疏水區(qū)域進(jìn)行序列改造或者截除[22-24]。真核生物的CYP也是膜結(jié)合蛋白，通常也利用N端疏水區(qū)域替換或去除的策略實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的可溶且活性形式的表達(dá)[25-27]。

本研究通過(guò)將云芝的全長(zhǎng)和去除預(yù)測(cè)的N端膜錨定區(qū)域 (第1–24個(gè)氨基酸殘基) 的分別在大腸桿菌中異源表達(dá)，最終獲得可溶性表達(dá)的CPRΔ24蛋白，對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析，為體外構(gòu)建CYP生物反應(yīng)酶系，研究云芝CPR和不同底物之間的相互作用，以及進(jìn)一步探究云芝CPR在環(huán)境有機(jī)污染物降解途徑中的功能機(jī)制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pET-28_TEV為本實(shí)驗(yàn)室在pET-28a(+)基礎(chǔ)上改造，即將凝血酶 (Thrombin) 酶切位點(diǎn)替換成煙草蝕紋病毒蛋白酶 (Tobacco etch virus protease，TEV) 酶切位點(diǎn)后保藏 (圖1)。

1.1.2 試劑及儀器

DNA marker 2K Plus Ⅱ、DNA聚合酶、DNA連接酶、限制內(nèi)切酶均為T(mén)aKaRa產(chǎn)品。柱純化試劑盒Ni-NTA、蛋白濃度測(cè)試試劑盒Bradford為生工生物工程 (上海) 股份有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué) (吳江) 有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純?cè)噭?。所用儀器：Eppendorf PCR儀 (Thermo Fisher Scientific-US)、DYY-6C電泳儀 (上海天能科技公司)、水平式電泳槽以及垂直電泳槽 (上海天能科技公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)SCIENTZ-IID (寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.3 引物

云芝全長(zhǎng)(GenBank Accession No. AB065368.1，2 190 bp，編碼全長(zhǎng)CPR蛋白730個(gè)氨基酸) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行全基因合成，并將酶切位點(diǎn)Ⅰ、Ⅰ引入，與pET-22b(+)載體連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)。設(shè)計(jì)去除N端膜錨定區(qū)域的的上下游引物分別命名為N1、N2，將酶切位點(diǎn)Ⅰ、Ⅰ分別引入，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表1)。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的片段

片段由全長(zhǎng)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。PCR體系為：模板即公司合成的包含全長(zhǎng)質(zhì)粒 (94 ng/μL) 1 μL；上下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL；Premix DNA聚合酶 (2×) 25 μL；加水補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行柱純化回收。

圖1 pET-28_TEV質(zhì)粒克隆/表達(dá)區(qū)域圖

表1 引物序列

The underlined letters indicate recognition site of specific restriction enzyme.

1.2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR N端24個(gè)氨基酸殘基組成的疏水膜錨定區(qū)域通過(guò)TMHMM Server v. 2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預(yù)測(cè)得到。應(yīng)用Clustal X2軟件對(duì)已獲得的云芝CPR氨基酸序列與GenBank已登錄的黃孢原毛平革菌、肉質(zhì)顯絲菌、綿腐臥孔菌、干朽菌、新型隱球菌、黑曲霉、粗糙脈孢霉、釀酒酵母和裂殖酵母的CPR氨基酸序列進(jìn)行多序列對(duì)比分析。

1.2.3 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28-和pET28-

將含有空載質(zhì)粒pET-28_TEV和公司提供的含有質(zhì)粒pET22b(+)-的分別搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。將所得pET-28_TEV空載質(zhì)粒、pET22b(+)-質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增獲得的分別進(jìn)行Ⅰ、Ⅰ雙酶切，酶切條件為37 ℃反應(yīng)4 h。膠回收相應(yīng)的基因片段和pET-28_TEV載體。載體與片段按摩爾比約1:17連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28-和pET28-；連接體系為：載體pET-28_TEV (約30 ng/μL) 1 μL，或酶切回收片段 (約50 ng/μL) 4 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，加入超純水補(bǔ)齊至10 μL，16 ℃連接過(guò)夜。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET28-和pET28-的轉(zhuǎn)化和鑒定

將上述獲得的重組表達(dá)載體pET28-和pET28-轉(zhuǎn)化至新鮮制備的表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有終濃度為30 μg/mL卡那霉素的抗性平板，37 ℃恒溫隔夜培養(yǎng)，用已滅菌牙簽挑取抗性單克隆菌落，15%甘油保菌并將菌株送樣至生工生物 (上海) 股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取經(jīng)驗(yàn)證無(wú)誤并冷凍保藏pET28-和pET28-大腸桿菌轉(zhuǎn)化子各50 μL，分別接入含有30 μg/mL卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到含有30 μg/mL卡那霉素的400 mL LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌體600達(dá)到0.6–0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，轉(zhuǎn)入16 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)16?24 h。4 ℃、8 000 r/min離心收集菌體，各用80 mL結(jié)合緩沖液 (20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 重懸菌體并超聲破碎，超聲功率250 W，開(kāi)2 s，關(guān)3 s，破碎30 min。將菌體破碎液12 000 r/min離心30 min后對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白純化

取出保存在4 ℃冰箱的鎳柱，用酒精重懸填料并在填料完全下沉后將柱內(nèi)酒精全部放出。先用3個(gè)柱體積去離子水沖洗柱子，然后加入約5 mL的電荷緩沖液 (0.2 mol/L NiSO4)，使Ni2+結(jié)合至柱材料上，然后用適量的去離子水洗去多余的Ni2+，最后用至少3個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡鎳柱。待鎳柱平衡好后，緩慢上樣破碎上清液。上樣結(jié)束后用2個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗去非特異性結(jié)合在柱子上的雜蛋白，接著用20 mmol/L和50 mmol/L的咪唑洗脫吸附在柱子上的雜蛋白，至洗脫液無(wú)蛋白 (280<0.05) 后，再用 200 mmol/L咪唑洗下目的蛋白并收集洗脫液，至目的蛋白完全被洗脫下來(lái) (最后一滴洗脫液280<0.05)。用分子篩預(yù)裝柱Hiload 16/60 Superdex200 column (GE healthcare) 繼續(xù)純化目的蛋白，分子篩所用緩沖液為：20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH 8.0。

1.2.7 重組酶酶學(xué)特性分析

最適作用pH：分別在不同pH緩沖液 (pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0) 下測(cè)定酶活性。pH 5.0–8.0 (1/15 mol/L KH2PO4-Na2HPO4)、pH 7.5–9.0 (50 mmol/L Tris-HCl)、pH 9.0–10.0 (100 mmol/L NaHCO3-Na2CO3)。其他條件按方法1.2.8，計(jì)算相對(duì)酶活。將pH梯度中對(duì)應(yīng)的最高酶活定義為100%。

最適作用溫度：分別在不同的溫度 (25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃) 下測(cè)定酶活性。其他條件按照方法1.2.8，計(jì)算相對(duì)酶活。將溫度梯度中對(duì)應(yīng)的最高酶活定義為100%。

添加劑 (金屬離子、添加物) 對(duì)酶活的影響：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別加入金屬離子Na+、K+、Ca2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+和EDTA終濃度為5 mmol/L，甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮的終濃度為10% (體積比)。對(duì)照組無(wú)任何添加劑并將其酶活定義為100%，其他條件按方法1.2.8，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.8 重組酶比酶活測(cè)定

酶活以氧化型細(xì)胞色素c作為重組酶的底物。根據(jù)最適pH和最適溫度以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定飽和底物濃度 (見(jiàn)方法1.2.9)，定義標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)體系為：1 mL酶活反應(yīng)體系中加入4 μg的重組酶，氧化型細(xì)胞色素c終濃度為100 μmol/L，NADPH終濃度為120 μmol/L，測(cè)定在35 ℃、pH 8.0的反應(yīng)條件下在5 min初始反應(yīng)階段產(chǎn)物還原型細(xì)胞色素c在550 nm處的吸收值。550的增長(zhǎng)速率換算成細(xì)胞色素c由氧化型向還原型的轉(zhuǎn)變速率。還原型細(xì)胞色素c的消光系數(shù)為 21.1 mmol/(L·cm)。

1.2.9 重組酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的表征

測(cè)定重組酶對(duì)細(xì)胞色素c和NADPH的動(dòng)力學(xué)表征參照Warrilow等的方法[23]。在酶反應(yīng)體系中加入不同濃度 (終濃度為0–200 μmol/L) 的氧化型細(xì)胞色素c和4 μg的重組酶，添加終濃度為120 μmol/L的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定并記錄開(kāi)始與在35 ℃、pH 8.0反應(yīng)條件下反應(yīng)5 min后的550。在酶反應(yīng)體系中加入終濃度為100 μmol/L的氧化型細(xì)胞色素c和4 μg的重組酶，添加不同濃度 (終濃度為0–200 μmol/L) 的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定并記錄開(kāi)始與在35 ℃、pH 8.0反應(yīng)條件下反應(yīng)5 min后的550。550的增長(zhǎng)速率換算成細(xì)胞色素c由氧化型向還原型的轉(zhuǎn)變速率。以上數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3次。利用Origin Pro 9.0和公式 (1) 對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，由公式 (1)、(2) 計(jì)算CPRΔ24對(duì)細(xì)胞色素c和NADPH的max、m和cat值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因獲得和重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

云芝全長(zhǎng)(GenBank Accession No. AB065368.1) 由公司合成并連接到pET-22b載體上，導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) 細(xì)胞。去除由N端24個(gè)氨基酸殘基組成的膜錨定區(qū)域的序列的獲得是以全長(zhǎng)基因?yàn)槟０?，?jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)。

將云芝去除膜錨定區(qū)域的擴(kuò)增片段插入到表達(dá)載體。經(jīng)菌落PCR及對(duì)重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證 (圖2)，顯示成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-，同時(shí)證明重組質(zhì)粒pET28-成功導(dǎo)入表達(dá)宿主大腸桿菌細(xì)胞中。

2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR的氨基酸序列和其他物種多序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示。云芝與白腐菌黃孢原毛平革菌、肉質(zhì)顯絲菌及褐腐菌綿腐臥孔菌、干朽菌的氨基酸序列同源性較高，分別為83%、81%和81%、78%。與非木腐菌新型隱球菌黑曲霉和粗糙脈孢菌的同源性分別為57%、45%、42%。與釀酒酵母和裂殖酵母的CPR氨基酸序列同源性較低，分別為37%和39%。

圖2 重組質(zhì)粒pET28-CPRΔ24的構(gòu)建和雙酶切鑒定

圖3 云芝CPR和其他物種CPR的氨基酸序列比對(duì)

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

SDS-PAGE檢測(cè)分析結(jié)果顯示，未見(jiàn)有重組CPR蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3) 中可溶性表達(dá) (圖4A)，而重組CPRΔ24獲得了明顯的可溶性表達(dá)，且表達(dá)蛋白的分子量與理論值 (78.35 kDa) 吻合 (圖4B)。利用重組CPRΔ24的N端His標(biāo)簽，通過(guò)鎳柱法分離純化目的蛋白，并利用分子篩層析法進(jìn)一步分離純化目的蛋白。重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

2.4 活性測(cè)定及酶學(xué)特性分析

2.4.1 比酶活

在35 ℃、pH 8.0的反應(yīng)條件下測(cè)定5 min內(nèi)550的變化，擬合重組CPRΔ24反應(yīng)初速度階段，定義酶活單位 (U) 為在35 ℃、pH 8.0的反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原型的細(xì)胞色素c所需要的酶量。計(jì)算得出重組酶比酶活為5.82 U/mg。

2.4.2 最適pH和最適溫度

測(cè)定云芝重組CPRΔ24的最適溫度為35 ℃。由圖7分析得出溫度在25?35 ℃間酶活逐漸升高，當(dāng)溫度大于40 ℃酶活明顯降低，表明該酶不適合在溫度較高條件下使用。酶的最適pH為8.0，當(dāng)pH低于6.5或高于9.0后酶活性均低于60%。

2.4.3 金屬離子和有機(jī)溶劑等對(duì)酶活性的影響

經(jīng)測(cè)定 (圖8)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)重組CPRΔ24具有明顯促進(jìn)作用的金屬離子，其中5 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)酶活影響較小，Co2+和Ni2+使酶活明顯降低，Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活，EDTA使酶活保持在80%以上。同時(shí)，加入不同的有機(jī)溶劑對(duì)酶活都有不同程度的抑制作用。10%的乙醇、異丙醇和丙酮使酶活降低50%多，10%甲醇存在時(shí)酶活保持在60%以上。

圖5 重組CPRΔ24鎳柱純化的SDS-PAGE分析

圖6 重組CPRΔ24分子篩純化結(jié)果圖

圖7 溫度(A) 和pH (B) 對(duì)重組CPRΔ24酶活的影響

圖8 添加劑對(duì)重組CPRΔ24酶活的影響

2.4.4 對(duì)底物細(xì)胞色素c和NADPH的動(dòng)力學(xué)表征

酶動(dòng)力學(xué)分析表明，重組CPRΔ24對(duì)底物細(xì)胞色素c的m為 (25.9±2.09) μmol/L，cat為10.2/s。對(duì)NADPH的m為 (19.7±1.33) μmol/L，cat為3.31/s (圖9)。

3 討論

白腐真菌能利用細(xì)胞色素P450酶系代謝一系列內(nèi)源和外源的化合物。黃孢原毛平革菌[11]、肉質(zhì)顯絲菌[28]靈芝[29]和毛栓孔菌[30-31]等真菌已完成基因組測(cè)序，已有多個(gè)得到鑒定，而關(guān)于白腐真菌CPR異源表達(dá)和酶學(xué)特性的研究還較少。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建云芝CPRΔ24 (去除N端膜錨定區(qū)域) 的表達(dá)載體pET-，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的異源表達(dá)，利用鎳柱親和純化和分子篩層析后測(cè)得重組CPRΔ24的比酶活為5.82 U/mg，酶的最適溫度與最適pH分別為35 ℃和8.0；金屬離子Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活，Co2+和Ni2+使酶活明顯降低，Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)酶活影響較小，EDTA使酶活保持在80%以上。同時(shí)，加入不同的有機(jī)溶劑對(duì)酶活都有不同程度的抑制作用。乙醇、異丙醇和丙酮使酶活降低50%以上，而甲醇存在時(shí)相對(duì)酶活保持在60%以上。重組CPRΔ24對(duì)細(xì)胞色素c的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和cat分別為25.9 μmol/L和10.2 /s；對(duì)NADPH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和cat分別為19.7 μmol/L和3.31/s。

黃孢原毛平革菌重組CPRΔ23 (去除N端膜錨定區(qū)域) 在25 ℃、pH 7.8的反應(yīng)條件下對(duì)細(xì)胞色素c的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m為 (11.54±0.29) μmol/L，比酶活為14.76 U/mg[23]；而云芝重組CPRΔ24在35 ℃、pH 8.0的反應(yīng)條件下對(duì)細(xì)胞色素c的動(dòng)力學(xué)參數(shù)m為 (25.9±2.09) μmol/L，比酶活為5.82 U/mg。二者在動(dòng)力學(xué)參數(shù)和比酶活數(shù)值上的差異可能與測(cè)試溫度和pH條件，以及二者因氨基酸序列上的不同導(dǎo)致的酶學(xué)特性的差異相關(guān)。

云芝的CPR在大腸桿菌中重組表達(dá)、純化和酶學(xué)特性的研究為體外構(gòu)建CYP酶反應(yīng)系統(tǒng)，以及體外研究云芝CPR和不同CYPs及其他類(lèi)型底物之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)一些不依賴于CPR的CYP電子傳遞體，如細(xì)胞色素b5和NADH依賴的細(xì)胞色素b5還原酶[32-34]。本研究也為分析云芝中其他類(lèi)型的CYP電子傳遞體和CPR之間的差異和聯(lián)系提供指導(dǎo)。

基于CPR和CYPs之間的作用關(guān)系及其電子供體的特性，CPR已被運(yùn)用到生物轉(zhuǎn)化及藥物代謝等多個(gè)研究領(lǐng)域。例如，在酵母細(xì)胞中共表達(dá)酵母的CPR和擔(dān)子菌的CYPs從而構(gòu)建有毒異生物轉(zhuǎn)化的功能篩選系統(tǒng)[35-36]；在酵母細(xì)胞中構(gòu)建人源CPR和CYP共表達(dá)的體系用作體外藥物代謝的篩選[37]等。雖然將某個(gè)CPR和一系列的編碼蛋白共表達(dá)以構(gòu)建功能篩選體系是對(duì)CYPs催化潛力更為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，但是在研究某個(gè)CYP的具體功能和電子傳遞路徑時(shí)往往需要將該CYP和特定的CPR分別表達(dá)、純化以進(jìn)行體外酶活檢測(cè)[27,38]。本實(shí)驗(yàn)室前期異源表達(dá)和純化了來(lái)源于毛栓菌AH28-2的一個(gè)編碼蛋白。鑒于云芝的CPR專(zhuān)一性不高，我們正在將該編碼蛋白和本研究中的CPR適配，進(jìn)行體外酚化合物脫毒反應(yīng)體系的構(gòu)建。這也為進(jìn)一步探究云芝CPR在環(huán)境有機(jī)污染物降解途徑中的功能機(jī)制提供幫助。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase fromin

Xuewa Sun1,2,3, Chao He1,2,3, Zeming Fang1,2,3, and Yazhong Xiao1,2,3

1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China 2 Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, Hefei 230601, Anhui, China 3Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230601, Anhui, China

has strong ability to degrade environmental organic pollutants. NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) oftransfers electron to cytochrome P450s (CYPs) and participates in the degradation process of organic pollutants. Sequence analysis showed that the genome ofcontains 1 potentialand multiple potentialsequences. To further study the molecular mechanism for the involvement ofCPR in the cellular degradation of organic pollutants, agene fromwas cloned and heterologously expressed in. Subsequently, the main properties of the recombinant enzyme were investigated. A truncated CPR protein lacking the predicted membrane anchor region (residues 1-24), named CPRΔ24, was overexpressed as a soluble form in. The recombinant CPRΔ24 protein showed a molecular weight consistent with the theoretical value of 78 kDa. Recombinant CPRΔ24 was purified using a Ni2+-chelating column followed by size exclusion chromatography. The specific activity of the purified CPRΔ24 was 5.82 U/mg. The CPRΔ24 enzyme displayed the maximum activity at 35 ℃ and pH 8.0. It has different degrees of tolerance against several types of metal ions and organic solvents.The apparentmandcatvalues of recombinant CPRΔ24 for NADPH were 19.7 μmol/L and 3.31/s, respectively, and those for the substrate cytochrome c were 25.9 μmol/L and 10.2/s, respectively, under conditions of 35 ℃ and pH 8.0. The above research provides the basis for exploring the functional mechanism ofCPR in the degradation pathway of environmental organic pollutants.

, NADPH-cytochrome P450 reductase,, heterologous expression, enzymatic properties

December 25, 2017;

February 8, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos.31370114, 31170056).

Yazhong Xiao. E-mail: yzxiao@ahu.edu.cnChao He. E-mail: chaohe@ahu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31370114, 31170056) 資助。

2018-06-08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180607.1128.002.html

10.13345/j.cjb.170517