王戰(zhàn)豪，王曉蕾，胡 俊，楊莉莉，謝 江，劉華偉，曹 敏，郭元彪△

(成都市第三人民醫(yī)院/西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院：1.臨床檢驗(yàn)部；2.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究部，成都 610000)

流感嗜血桿菌(Hi)是呼吸道感染的重要致病菌之一[1-2]。近年來由于抗菌藥物的廣泛使用，Hi對氨芐西林的耐藥率呈明顯上升趨勢[3-4]。因此，及時(shí)正確地檢出對氨芐西林耐藥的Hi，對預(yù)防及控制耐藥株暴發(fā)流行至關(guān)重要。臨床工作中，尤其在基層醫(yī)院，基于微量肉湯稀釋法的自動(dòng)化微量肉湯稀釋法(ATB法)更為廣泛地應(yīng)用于Hi的藥物敏感性試驗(yàn)[5-6]。但是，大部分ATB法試劑盒提供的藥物濃度折點(diǎn)較少，有的甚至僅有1個(gè)判讀敏感的濃度孔。一旦抗菌藥物敏感、耐藥判讀折點(diǎn)發(fā)生變化，則有可能導(dǎo)致判讀結(jié)果錯(cuò)誤，對臨床用藥產(chǎn)生誤導(dǎo)[7]。因此，校正ATB法在實(shí)際工作中產(chǎn)生檢測結(jié)果的誤差具有重要的意義。

目前，雖然肉湯稀釋法為藥物敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，但是其操作過程繁瑣，試驗(yàn)要求嚴(yán)苛，故臨床實(shí)際工作中較少應(yīng)用。E-test法與肉湯稀釋法有著較好的一致性，操作簡便，技術(shù)要求相對較低。因此，本研究擬用肉湯稀釋法為參考方法，探討在Hi的氨芐西林藥物敏感性試驗(yàn)中，E-test法對ATB法的校正能力，以期獲得切實(shí)有效的校正方法，提高自動(dòng)化藥物敏感性鑒定法檢測的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1材料來源 Hi來源于2013-2014年四川成都、都江堰、德陽地區(qū)的4家醫(yī)院。所有菌株的接種和培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第2版)》進(jìn)行。標(biāo)本采用選擇性培養(yǎng)基，即血平板和嗜血桿菌巧克力平板進(jìn)行初步的篩選培養(yǎng)。之后，挑取典型的Hi菌落進(jìn)一步分離培養(yǎng)，并取菌落涂片并革蘭染色進(jìn)行初步鑒定。然后再次用衛(wèi)星試驗(yàn)、Ⅴ因子、Ⅹ因子及Ⅴ+Ⅹ因子紙片鑒定分離的流感嗜血桿菌。按ATB Expression鑒定/藥物敏感性系統(tǒng)的操作規(guī)程及所述方法進(jìn)行最終的鑒定[8-9]。

1.2主要試劑 嗜血桿菌巧克力平板和血平板(重慶龐通生物技術(shù)有限公司)；藥物敏感性培養(yǎng)基：水解酪蛋白胨(MH)肉湯(英國Oxoid公司)加流感嗜血桿菌添加劑；Ⅴ因子、Ⅹ因子及Ⅴ+Ⅹ因子紙片(英國Oxoid公司)；ATB的Hi藥物敏感性試驗(yàn)板條(法國BioMérieux公司)；E-test的Hi氨芐西林藥物敏感性試紙條(法國梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1最小抑菌濃度(MIC)孔板制備 將HTM標(biāo)準(zhǔn)肉湯加入孔板的第1～10孔中，每孔加100 μL。然后，將倍比稀釋后不同濃度的氨芐西林藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1～8孔加藥液，每孔100 μL；第9孔作為陰性對照(孔中無抗菌藥物和細(xì)菌)，第10孔作為陽性對照(孔中無抗菌藥物，但有細(xì)菌)。冰凍干燥后密封，-20 ℃以下保存?zhèn)溆?。整個(gè)試驗(yàn)過程保證無菌操作。

1.3.2菌懸液制備及菌落計(jì)數(shù) 挑取處于對數(shù)生長期的新鮮單克隆Hi菌落于無菌生理鹽水中，使其乳化形成約5×106CFU/mL的菌懸液。將準(zhǔn)備好的5×106CFU/mL的菌懸液，倍比稀釋至終濃度為5×102CFU/mL；取100 μL稀釋后的菌懸液至無菌空平皿中，最后，再向空平皿中加入16～20 mL 46 ℃左右的HTM瓊脂，搖勻后制成平板。將平板置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育24～48 h。最后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確認(rèn)MIC孔板內(nèi)接種菌量在規(guī)定的范圍內(nèi)。

1.3.3加樣 5×106CFU/mL的菌懸液制備后15 min內(nèi)，用連續(xù)加樣單槍向制備好的MIC孔板中加入10 μL菌懸液，每孔含菌量約為5×104CFU。將孔板置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育18～24 h。根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2016年標(biāo)準(zhǔn)[10]判讀并記錄藥物敏感性結(jié)果。

1.3.4E-test法藥物敏感性試驗(yàn) 挑選處于對數(shù)生長期的新鮮單克隆Hi菌落，將Hi溶于0.9%無菌生理鹽水中，用比濁儀將菌液調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝弧Ｓ脽o菌棉簽浸入調(diào)節(jié)好的Hi懸液，將多余Hi懸液在管壁上擠出，在HTM平板上反復(fù)涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板周圍涂兩圈，保證涂布均勻。平板在室溫下干燥3～5 min后，將氨芐西林藥物敏感性試紙條(法國梅里埃公司)貼在HTM平板上，每個(gè)HTM平板平行貼2條藥物敏感性紙條，確保紙條間距滿足藥物敏感性試驗(yàn)要求，一旦貼在某一位置，不應(yīng)變動(dòng)位置。15 min后，將貼有紙條的HTM平板置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育18～24 h。藥物敏感性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI 2016年標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3.5ATB法藥物敏感性試驗(yàn) 參照ATB HAEMO嗜血桿菌藥物敏感性試驗(yàn)板條的操作說明書對氨芐西林進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，用ATB細(xì)菌鑒定和藥物敏感性儀讀取結(jié)果。藥物敏感性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI 2016年標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。具體操作步驟如下：挑選處于對數(shù)生長期的新鮮單克隆Hi菌落，配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，用微量移液器?0 μL菌懸液于標(biāo)準(zhǔn)液中，將含菌懸液的試管至震蕩儀器上震蕩使其充分混合均勻，用微量移液器將135 μL菌懸液分別加樣于ATB藥物敏感性條空白對照孔及含抗菌藥物藥物敏感性孔，放置ATB藥物敏感性條于37 ℃，5% CO2孵箱孵育18～24 h，結(jié)合空白對照，根據(jù)加樣孔中是否有細(xì)菌生長判斷Hi對其敏感性，若Hi生長判讀為耐藥，無Hi生長則判讀為敏感。

1.3.6生物學(xué)分型及β-內(nèi)酰胺酶檢測 挑選處于對數(shù)生長期的新鮮單克隆Hi菌落，將Hi溶于0.9%無菌生理鹽水中，用比濁儀將菌液調(diào)整至3麥?zhǔn)蠁挝?。加入NH鑒定條(賽默飛世爾生物有限公司)并放置普通孵箱37 ℃孵育4 h。通過顯色反應(yīng)，根據(jù)賽默飛世爾生物有限公司細(xì)菌鑒定軟件判斷結(jié)果。通過吲哚試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)和鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)反應(yīng)的不同將Hi分為8種(Ⅰ～Ⅷ)生物型。通過頭孢硝基酚顯色反應(yīng)法，檢測Hi的β-內(nèi)酰胺酶。將頭孢硝基酚紙片用無菌水濕潤，涂適量Hi于濕潤的紙片上。10 min后觀察紙片顏色，若紙片顯示紅色，β-內(nèi)酰胺酶為陽性；若紙片不變色，β-內(nèi)酰胺酶則為陰性。

1.3.7藥物敏感性質(zhì)控 依據(jù)CLSI 2016年標(biāo)準(zhǔn)，肉湯稀釋法檢測Hi(ATCC49247)對氨芐西林的MIC值為2～8 μg/mL；E-test法檢測Hi(ATCC49247)對氨芐西林的MIC值為2～8 μg/mL；ATB法檢測標(biāo)準(zhǔn)Hi(ATCC49247)對氨芐西林的MIC值為2～8 μg/mL；每次實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株的MIC值在以上范圍內(nèi)，才能記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.8體外藥物敏感性方法結(jié)果的一致性分析 本研究以肉湯稀釋法為參考方法，分析E-test法和ATB法的體外藥物敏感性試驗(yàn)法與該標(biāo)準(zhǔn)的一致性。觀察指標(biāo)如下：一致率，為E-test法、ATB法與肉湯稀釋法在體外測試所得敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)結(jié)果一致的例數(shù)除以總例數(shù)；極重大誤差率，為E-test法或ATB法的結(jié)果為S而肉湯稀釋法結(jié)果為R的例數(shù)除以肉湯稀釋法結(jié)果為R的例數(shù)；重大誤差率，為肉湯稀釋法為S而其他方法結(jié)果為R的例數(shù)除以肉湯稀釋法結(jié)果為S的例數(shù)；次要誤差率，為肉湯稀釋法結(jié)果為R或S而其他方法結(jié)果為I的例數(shù)加上肉湯稀釋法結(jié)果為I而其他方法結(jié)果為R或S的例數(shù)除以總例數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。其中，樣本量小于40或有格子的期望頻數(shù)小于1時(shí)，采用Fisher精確概率法。運(yùn)用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行方法的一致性分析(Kappa≥0.75，一致性好；Kappa≥0.4且Kappa<0.75，一致性一般；Kappa<0.4，一致性較差)；以線性回歸檢驗(yàn)肉湯稀釋法與E-test MIC值的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ATB法、E-test法與肉湯稀釋法的藥物敏感性結(jié)果一致性比較 檢測227株Hi對氨芐西林的藥物敏感性結(jié)果：S，50株；I，19株；R，158株。E-test法藥物敏感性結(jié)果：S，68株；I，37株；R，122株。ATB法藥物敏感性結(jié)果：S，63株；I，0株；R，164株。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肉湯稀釋法與E-test法的MIC值呈正相關(guān)(r=0.612)。E-test法與肉湯稀釋法檢測結(jié)果的一致性一般(Kappa=0.460)，一致率為70.48%；ATB法與肉湯稀釋法檢測結(jié)果的一致性較差(Kappa=0.323)，一致率為70.48%。將兩種方法結(jié)合可將檢測的一致率提高至87.67%，顯著高于單獨(dú)的E-test法或ATB法(χ2=20.247，P<0.001)。結(jié)果誤差方面，ATB法的重大誤差率(42.0%)顯著高于E-test法(6.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；E-test法的次要誤差率顯著高于ATB法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.018，P=0.002)；二者的極重大誤差率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.604，P=0.437)，見表1。

表1 E-test法、ATB法與肉湯稀釋法藥物敏感性結(jié)果一致性的比較(n=227)

2.2E-test法對ATB法產(chǎn)生的重大誤差結(jié)果的校正 總體上，ATB法有71.43%(15/21)的重大誤差率可被E-test法校正。被校正的菌株中，β-內(nèi)酰胺酶陰性菌株占93.33%(14/15)；而未被校正的菌株中，β-內(nèi)酰胺酶陰性占66.67%(4/6)，二者結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.184)。從生物學(xué)分型來看，校正和未校正菌株以Ⅰ型和Ⅳ型為主，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.299)。

2.3E-test法對ATB法產(chǎn)生的極重大誤差結(jié)果的校正 ATB法有62.96%(17/27)的極重大誤差可被E-test法校正。被校正的菌株中，β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株占70.59%(12/17)，顯著高于未被校正的菌株(1/10)(P=0.004)。從生物學(xué)分型來看，校正和未校正菌株以Ⅰ型和Ⅳ型為主，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。

2.4E-test法對ATB產(chǎn)生的次要誤差結(jié)果的校正 ATB法有6.84%的次要誤差可被E-test法校正。共有19株經(jīng)肉湯稀釋法測定為藥物敏感性I，其中7株的ATB結(jié)果可被E-test法校正。未被校正的菌株中，5株被E-test法判定為R，7株為S；而ATB法判定為R的則為9株，S的為3株。從生物學(xué)分型來看，被校正菌株中的Ⅰ型菌株所占比例[71.43%(5/7)]顯著高于未校正Ⅰ型菌株[16.67%(2/12)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)。校正和未校正菌株間β-內(nèi)酰胺酶差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.263)。

3 討 論

臨床工作中，由于大多自動(dòng)化藥物敏感性鑒定試劑廠家提供的反應(yīng)孔內(nèi)抗菌藥物濃度是固定的，同一種抗菌藥物包括1個(gè)低濃度孔(用于S的判讀)和1個(gè)高濃度孔(用于耐R的判讀)，有的僅有1個(gè)判讀S的濃度孔，甚至與CLSI M100-S26文件推薦的抗菌藥物折點(diǎn)不一致，這都暴露出ATB法在實(shí)際應(yīng)用的缺陷。本研究ATB法結(jié)果顯示，Hi對氨芐西林藥物敏感性結(jié)果的準(zhǔn)確性上確實(shí)存在不足，可能對臨床治療產(chǎn)生誤導(dǎo)。比如，ATB法判定為氨芐西林R的菌株中有42.00%(21/50)會(huì)帶來重大誤差，判定為氨芐西林S的菌株中有17.09%(27/158)會(huì)帶來極重大誤差。目前，ATB法聯(lián)合其他藥物敏感性方法糾正其對Hi的藥物敏感性結(jié)果的參考文獻(xiàn)較少。本研究以肉湯稀釋法為參考方法，初步探討E-test法對ATB法藥物敏感性結(jié)果的校正作用。

結(jié)果顯示，與肉湯稀釋法相比，E-test法和ATB法的一致率均為70.48%，兩者聯(lián)合可將檢測的一致率提高至87.67%，顯著高于ATB法(χ2=20.247，P<0.001)；ATB法的重大誤差率(42.0%)顯著高于E-test法(6.0%)(Fisher的精確檢驗(yàn)，P=0.002)。E-test法可校正ATB法71.43%的重大誤差、62.96%的極重大誤差以及6.84%的次要誤差。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，如果ATB法判定為氨芐西林敏感的菌株，一定要做β-內(nèi)酰胺酶分析，對于β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株建議采用E-test法進(jìn)行校正，而且80.0%(12/15)的結(jié)果最終可被確認(rèn)。

被肉湯稀釋法判定為I的19株菌株中，ATB法判定為R的占63.2%(12/19)，而E-test法判定為R的僅占26.3%(5/19)，二者結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明，在氨芐西林藥物敏感性試驗(yàn)中，E-test法更容易將Hi中介菌株的藥物敏感性表型判定為S。這可能是E-test法能夠?qū)TB法產(chǎn)生重大誤差中β-內(nèi)酰胺酶陽性的耐藥菌株校正為S的原因[11]。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室對Hi的藥物敏感性檢測主要采用紙片擴(kuò)散法，該方法簡單易行，但需批量配制Hi專用的藥物敏感性平板，比較適合標(biāo)本量大的醫(yī)院，否則平板容易失效，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然ATB法有一些不足，但是其操作方便，有效期更長，現(xiàn)在在基層醫(yī)院的應(yīng)用較為普遍[12-13]。結(jié)果表明，與肉湯稀釋法相比，E-test法和ATB法的一致率均為70.48%，二者的極重大誤差率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.604，P=0.437)，這說明ATB法的結(jié)果較為可信，而且不同生物學(xué)分型菌株之間的藥物敏感性結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故藥物敏感性試驗(yàn)中可不進(jìn)行菌株的生物學(xué)分型。但是，ATB法的重大誤差率(42.0%)顯著高于E-test法(6.0%)，故進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析了兩種方法的重大誤差率，并得出以下結(jié)論，如果ATB法判定為氨芐西林敏感且β-內(nèi)酰胺酶陽性的菌株，建議采用E-test法進(jìn)行校正。