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高原低壓低氧環(huán)境對(duì)人體各器官均有影響，其中腦組織是最易受損的器官之一，低壓低氧可導(dǎo)致認(rèn)知功能受損，如注意力、感知能力和記憶力等[1-2]。Shi等[3]在低壓低氧艙模擬高原的實(shí)驗(yàn)中，急性低壓低氧8 h，小鼠的電迷宮測(cè)試成績(jī)明顯降低。有研究表明，乙酰膽堿(Ach)可能參與了高原低壓低氧引起的腦功能損害病理生理過(guò)程[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丁苯酞(dl-3 -n-butylphthalide， NBP)能提高缺氧小鼠腦組織抗氧化應(yīng)激的能力，延長(zhǎng)缺氧小鼠存活時(shí)間[5]。也有研究表明，NBP能作用于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，改善腦損傷后引起的記憶障礙[6]。本研究旨在觀察NBP預(yù)處理對(duì)低壓低氧小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期、平均速度以及海馬組織中Ach含量和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性的影響，為進(jìn)一步開(kāi)展NBP防治高原腦損害的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 NBP懸液：取NBP(純品，由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)051201)0.9 mL和Tween80 1.25 g置于250 mL量杯中，加蒸餾水至250 mL搖勻，備用。蒸餾水懸液：取Tween80 1.25 g置于250 mL量杯中，加蒸餾水至250 mL搖勻，備用。Ach測(cè)定試劑盒及ChAT試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。主要儀器：FLYDWC-IA型低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(中航工業(yè)貴州風(fēng)雷公司)，超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，Morris水迷宮MT2000(成都泰盟)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及實(shí)驗(yàn)方法 SPF級(jí)健康成年雄性昆明小鼠(由新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心提供)，體重19 g～23 g，按標(biāo)準(zhǔn)分籠飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(軍)2002-015。實(shí)驗(yàn)前自由飲食，飼養(yǎng)室及實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(23～25)℃，濕度在40%～45%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)期間對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。根據(jù)末次訓(xùn)練逃跑潛伏期成績(jī)，挑選成績(jī)較好的42只小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。將42只小鼠隨機(jī)分為3組(每組14只)：常壓常氧對(duì)照組、低壓低氧對(duì)照組和低壓低氧實(shí)驗(yàn)組。低壓低氧實(shí)驗(yàn)組：給予小鼠NBP懸液2 mL/kg灌胃，2次/日，5 d后將小鼠置于低壓低氧實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，按程序減壓至預(yù)定海拔，持續(xù)8 h。低壓低氧對(duì)照組：給予小鼠蒸餾水懸液灌胃，其他同低壓低氧實(shí)驗(yàn)組。常壓常氧對(duì)照組：除低壓低氧實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)空氣保持與周?chē)h(huán)境相通外，其他同低壓低氧對(duì)照組。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組隨機(jī)拿出7只小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，其余于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取海馬腦組織進(jìn)行Ach含量及ChAT活性測(cè)定。

模擬急性低壓低氧實(shí)驗(yàn)方法：將小鼠置于低壓低氧艙內(nèi)，按100 m/min的減壓速度達(dá)到預(yù)定海拔(6 000 m)，持續(xù)8 h后按同樣速度增壓至實(shí)驗(yàn)室環(huán)境氣壓水平。艙內(nèi)溫度、濕度與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一致，小鼠可在實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)自由飲食。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在水池壁上標(biāo)注A、B、C、D 4個(gè)入水點(diǎn)，將水迷宮等分成4個(gè)象限，利用計(jì)算機(jī)軟件記錄各組小鼠搜索平臺(tái)的逃逸潛伏期時(shí)間及平均速度，表示小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。若小鼠60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)上平臺(tái)，小鼠每搜索1次須在平臺(tái)上休息至少15 s。實(shí)驗(yàn)在安靜、光線(xiàn)柔和的房間內(nèi)進(jìn)行，水溫控制在(22.0±0.5)℃。

1.4 海馬組織Ach含量及ChAT活性測(cè)定 小鼠出艙后立即斷頭于冰臺(tái)上迅速取海馬組織稱(chēng)重，加入冰生理鹽水制成10%的組織勻漿，將勻漿在4℃以下2 000 r/min離心10 min，取其上清，放入-20 ℃以下冰箱中保存?zhèn)溆?。按Ach與ChAT活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與常壓常氧對(duì)照組比較，低壓低氧對(duì)照組和低壓低氧實(shí)驗(yàn)組的潛伏期明顯延長(zhǎng)，平均速度顯著減慢(P<0.05或P<0.01)；與低壓低氧對(duì)照組比較，低壓低氧實(shí)驗(yàn)組的潛伏期顯著縮短，平均速度顯著增快(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

組別n潛伏期(s)平均速度(cm/s)常壓常氧對(duì)照組726．39±8．4424．91±4．61低壓低氧對(duì)照組7 44．60±7．802) 7．69±4．332)低壓低氧實(shí)驗(yàn)組7 35．97±4．491)3) 13．58±5．332)3) 與常壓常氧對(duì)照組比較，1)P<0．05，2)P<0．01；與低壓低氧對(duì)照組比較，3)P<0．05。

2.2 小鼠海馬組織乙酰膽堿含量和ChAT活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與常壓常氧對(duì)照組比較，低壓低氧對(duì)照組乙酰膽堿含量和ChAT活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與低壓低氧對(duì)照組比較，低壓低氧實(shí)驗(yàn)組的乙酰膽堿含量和ChAT活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

組別n乙酰膽堿(mg/g)ChAT活性(U/g)常壓常氧對(duì)照組78．11±0．35 271．0±70．1 低壓低氧對(duì)照組77．56±0．421)167．4±46．22)低壓低氧實(shí)驗(yàn)組78．00±0．283)238．4±65．44) 與常壓常氧對(duì)照組比較，1)P<0．05，2)P<0．01；與低壓低氧對(duì)照組比較，3)P<0．05，4)P<0．01。

3 討 論

Morris水迷宮可以反映鼠類(lèi)空間學(xué)習(xí)記憶的形成和維持時(shí)間，定位航行試驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物獲取經(jīng)驗(yàn)即學(xué)習(xí)能力，逃逸潛伏期的長(zhǎng)短代表學(xué)習(xí)能力的高低；空間探索試驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物記憶保持的能力，測(cè)量值增加或減少提示記憶保持能力增強(qiáng)或減弱[7]，在Morris水迷宮試驗(yàn)中模擬高原低壓低氧環(huán)境可使小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶保持能力下降，對(duì)學(xué)習(xí)記憶行為具有損害作用[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠空間記憶能力變化的觀察顯示，低壓低氧可使小鼠逃逸潛伏期延長(zhǎng)，平均速度減慢，說(shuō)明低壓低氧可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間記憶能力下降，這與以往的研究報(bào)道[9]一致。NBP預(yù)處理小鼠逃逸潛伏期較低壓低氧對(duì)照組縮短，平均速度也較低壓低氧對(duì)照組增加，說(shuō)明NBP可以減輕急性低壓低氧對(duì)小鼠空間記憶的損害。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)重要的組成部分，參與整合外界信息，與空間位置的學(xué)習(xí)及近期記憶中的情節(jié)記憶過(guò)程均關(guān)系密切，其結(jié)構(gòu)完整性以及各種神經(jīng)遞質(zhì)的相互作用均在認(rèn)知形成的過(guò)程中起著重要作用，其中Ach的合成及含量與認(rèn)知、學(xué)習(xí)及記憶功能的關(guān)系尤為密切[10]。Ach是存在于腦內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于神經(jīng)信號(hào)傳遞有著重要的作用，同時(shí)也是海馬賴(lài)以維持膽堿能系統(tǒng)正常運(yùn)行的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與學(xué)習(xí)、記憶等相關(guān)生理活動(dòng)，當(dāng)Ach含量增高時(shí)，神經(jīng)傳導(dǎo)功能就會(huì)增強(qiáng)，以致加快神經(jīng)元間信息傳遞的速度，記憶能力也隨之增強(qiáng)[11]，癡呆病人常伴隨腦脊液Ach活性及含量的降低[12]。有研究提示丁苯酞可以抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)海馬起到保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，改善認(rèn)知功能障礙。ChAT是催化合成Ach的限速酶，通過(guò)膽堿能受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，與Ach的分布平行，常作為研究膽堿能神經(jīng)元的一項(xiàng)特殊指標(biāo)，若ChAT的活性發(fā)生異常，則會(huì)引起Ach代謝失調(diào)，導(dǎo)致中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生生化改變[13]。Muthuraju 等[14]將大鼠放置于低壓低氧艙(模擬海拔6 100 m)，大鼠記憶功能下降伴隨Ach下降，Ach活性增加和ChAT表達(dá)下降，表明膽堿功能失調(diào)參與了低壓低氧導(dǎo)致的記憶功能障礙損害的過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)低壓低氧可使小鼠海馬Ach含量降低，同時(shí)伴隨ChAT活性減低，這與Irimajiri等[4]的研究結(jié)果相一致。NBP的活性成分是dl-3-正丁苯酞，是人工合成的消旋體，其左旋體存在于芹菜籽中，可改善腦損傷后的微循環(huán)、能量代謝，減輕神經(jīng)功能損傷，涉及腦損傷多個(gè)病理環(huán)節(jié)，對(duì)腦損傷具有良好的治療作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)NBP預(yù)處理過(guò)的小鼠在低壓低氧環(huán)境作用下，Ach含量及ChAT活性下降的幅度比未進(jìn)行預(yù)處理的小鼠要小，說(shuō)明NBP在低壓低氧作用下可以增加Ach的含量及ChAT的活性。NBP預(yù)處理組與常壓常氧組比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Ach含量及ChAT活性有下降的趨勢(shì)，擴(kuò)大樣本量、增強(qiáng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

NBP可減輕低壓低氧引起的小鼠腦損傷，增加海馬組織中Ach含量及ChAT活性，改善記憶狀況，提示NBP在高原低壓低氧環(huán)境下對(duì)腦功能有保護(hù)作用。