王國輝 王麗華 秦麗紅 寧樹君 吳佳歡

佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（黑龍江佳木斯154002）

帕金森病是中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)病變疾病，基本病理特征是黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性及功能缺失，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)的異常［1］，近年來發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用［2-4］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為胞外一種高遷移率族蛋白，不僅在胞外可以啟動/放大炎癥性免疫反應(yīng)，而且其引發(fā)的炎癥反應(yīng)在腦組織中發(fā)揮著重要的作用［5］。尤其是在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中，HMGB1高表達可以促進星形膠質(zhì)細胞激活RAGE?MAPK信號，從而促進趨化因子、環(huán)氧化酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9等諸多生物活性分子的表達［6］。研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1可以引起腦組織IL?6等炎癥因子表達［7］。這一系列神經(jīng)炎癥性因子的表達可以促進神經(jīng)細胞的凋亡，促進中樞退行性疾病的發(fā)生和進展。本研究主要探討帕金森病患者中HMGB1及其受體Toll樣受體4（TLR4）的表達與帕金森病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并做一探討，為臨床中帕金森病的研究提供參考和支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2015年6月至2017年6月就診并確診為帕金森的患者120例（PD組），納入標準為：（1）運動緩慢：隨意運動的啟動緩慢、病情進展后，重復性動作的速度及幅度進行性降低；（2）符合以下癥狀之一：肌強直，靜止性震顫（4～6 Hz），姿勢平衡的障礙（非由于原發(fā)性的視覺、前庭、小腦及本體感覺功能障礙造成的）。排除標準為：（1）反復腦卒中發(fā)作伴隨帕金森病癥的階梯性進展；（2）腦損傷史；（3）在應(yīng)用精神藥物中出現(xiàn)的癥狀；（4）起病3年后仍表現(xiàn)為單側(cè)癥狀的患者；（5）小腦病變體征；（6）Babinski等病理征（+）；（7）CT或者磁共振檢查顯示腦部腫瘤等器質(zhì)性病變；（8）大劑量左旋多巴治療后無效的患者。入組的帕金森病患者還符合以下輔助診斷的3項及以上：（1）單側(cè)起?。唬?）靜止性震顫；（3）逐漸進展；（4）癥狀不對稱，起病側(cè)較重；（5）左旋多巴有明顯療效（70% ～100%有效）；（6）左旋多巴導致嚴重的異動癥；（7）左旋多巴療效持續(xù)5年及以上；（8）病程10年及以上。120例患者根據(jù)Hoehn?Yahr分級標準，其中Ⅰ級40例，Ⅱ級35例，Ⅲ級35例，Ⅳ級10例，Ⅴ級0例。選擇同期于我院體檢中心的健康人100例作為對照組。入組時排除感染性疾病、免疫抑制劑、激素使用等。該研究所有患者信息、血液樣本等均獲得患者或家屬知情并同意及倫理委員會批準。

1.2 標本收集及檢測 所有入住帕金森病患者及健康人均禁食12 h后采集外周靜脈血2 mL，室溫下靜置0.5 h后離心20 min，取上層血清，-80℃條件下保存。應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定血清中HMGB1?TLR4軸及髓樣分化因子（MyD88）、核因子κB（NF?κB）、腫瘤壞死因子α（TNF?α）的表達水平。用酶標儀在450 nm處測定吸光度A，以標準品的濃度為橫坐標，A為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)A帶入標準曲線擬合方程式，計算血清樣本中HMGB1和TLR4、MyD88、NF?κB、TNF?α的水平，結(jié)果以ng/L表示。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0軟件分析，方法采用方差分析（F分析），PD組和對照組的比較采用LSD法，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象基本資料的對比 帕金森患者120例（PD組）和對照組100例，在年齡組成、性別組成、基礎(chǔ)疾病、吸煙史、體質(zhì)量等基礎(chǔ)資料比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 患者基礎(chǔ)資料對比Tab.1 Comparison of patients′basic data 例（%）

2.2 兩組研究對象血清中HMGB1和TLR4的表達水平比較 帕金森病患者外周血中HMGB1為（5.96±2.10）ng/L顯著高于對照組（1.30±0.18）ng/L（F=18.32，P＜0.001），帕金森病患者外周血中TLR4為（2.56±0.78）ng/L顯著高于對照組（0.87±0.12）ng/L（F=26.31，P＜ 0.001）。帕金森病患者外周血HMGB1和TLR4表達有一定相關(guān)性（r=0.757 8，圖1）。

2.3 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與分期的關(guān)系 Ⅰ期帕金森病患者HMGB1表達為（3.53±1.01）ng/L，Ⅱ期表達為（6.41±0.87）ng/L，Ⅲ期表達為（7.16±0.68）ng/L，Ⅳ期表達為（8.44±1.12）ng/L，各分期均顯著高于對照組（t=3.25、5.47、8.36、12.11，均P＜0.001），而Ⅰ期中TLR4為（1.67±0.40）ng/L，Ⅱ期為（2.57±0.51）ng/L，Ⅲ期為（3.11±0.42）ng/L，Ⅳ期為（3.89±0.61）ng/L，各分期均顯著高于對照組（t=3.24、6.54、8.21、10.32，均P＜0.001）。HMGB1和TLR4隨著帕金森病分期的增高，表達顯著增高。見圖2。

圖1 帕金森病患者外周血中HMGB1和TLR4的表達的相關(guān)性（n=120）Fig.1 Correlation of expression of HMGB1 and TLR4 in peripheral blood of patients with Parkinson′s disease（n=120）

圖2 帕金森病分期與患者血清中HMGB1和TLR4的表達的關(guān)系（n=120）Fig.2 The relationship among the stage of Parkinson′s disease and the expression of HMGB1 and TLR4 in the serum of the patients（n=120）

2.4 帕金森患者者血清HMGB1和TLR4的表達與臨床分型的關(guān)系 將120例患者按照臨床表現(xiàn)分為混合型、震顫型和強直型?；旌闲偷呐两鹕颊吲R床表現(xiàn)主要為同時有肢體震顫和肌肉強直的表現(xiàn)；震顫型帕金森患者的臨床表現(xiàn)主要為肢體震顫，肌肉強直不明顯；強直型帕金森患者的臨床表現(xiàn)主要為肌肉的僵硬。組間比較HMGB1和TLR4差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.5 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與藥物治療的關(guān)系 120例帕金森病患者均接受多巴胺類藥物及其酶抑制劑的聯(lián)合治療，其中83例控制良好，37例藥物控制不佳出現(xiàn)了病情的進展。在對其血清HMGB1和TLR4的表達分析后，藥物控制良好的患者（有效組）HMGB1的表達為（4.25±0.65）ng/L、TLR4的表達為（2.31±0.87）ng/L，而藥物控制不佳的患者（難治組）HMGB1的表達為（6.43±1.14）ng/L、TLR4的表達為（3.10±0.93）ng/L，兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=13.21、15.22；均P＜ 0.001）。

表2 帕金森患者血清HMGB1和TLR4的表達與臨床分型的關(guān)系Tab.2 The relationship among the expression of HMGB1 and TLR4 in the serum of Parkinson patients and the clinical typing

2.6 帕金森病患者血清HMGB1和TLR4的表達與病程的關(guān)系 120例帕金森患者按照病程分類，其中＜4年為52例，4～8年為46例，＞8年以上為22例。其中病程＜4年的帕金森病患者血清中HMGB1的表達為（3.87±0.85）ng/L，TLR4的表達為（1.85±0.49）ng/L，病程4～8年的患者HMGB1的表達為（5.41±0.76）ng/L，TLR4的表達為（2.52± 0.63）ng/L，病程＞8年的的患者HMGB1的表達為（6.13±1.12）ng/L，TLR4的表達為（3.13±0.86）ng/L，而組間比較HMGB1和TLR4的表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003、0.001）。

2.7 帕金森病患者血清中HMGB1?TLR4軸下游因子MyD88、NF?κB以及TNF?α的表達 正常健康人中MyD88（518.2 ± 63.4）ng/L、NF?κB（985.3 ±114.6）ng/L以及TNF?α（207.3± 27.4）ng/L的表達顯著高于帕金森病患者MyD88（879.2±85.3）ng/L、NF?κB（1 453.4 ± 184.6）ng/L 以及 TNF?α（415.3 ±46.7）ng/L（F=15.32、22.31、18.32，P=0.000、0.000、0.000）。見圖3。

圖3 帕金森病患者血清中HMGB1?TLR4軸下游因子MyD88、NF?κB以及TNF?α的表達（n=120）Fig.3 Expression of the HMGB1?TLR4 axis downstream factors MyD88，NF?κB，and TNF?α in the serum of patients with Parkinson′s disease（n=120）

3 討論

隨著對HMGB1的深入研究后發(fā)現(xiàn)，HMGB1和TLR4介導的炎癥反應(yīng)與多種疾病有關(guān)，有敗血癥、腦膠質(zhì)瘤等［7-8］。HMBGI?TLR4軸是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，受損壞的細胞、激活的巨噬細胞等均可以主動/被動釋放HMGB1，釋放后可以通過信號通路誘導TNF?α和IL?6等炎癥因子的分泌，而早期致炎因子及HMGB1本身又可以促進HMGB1的釋放，形成環(huán)路后可以放大炎癥反應(yīng)［9-11］。Toll樣受體TLR4作為細胞表面識別受體，可以識別內(nèi)源性的HMGB1，TLR4激活后可以募集髓樣分化因子MyD88樣接頭蛋白，而MyD88可以與IL?1等受體相關(guān)激酶家族蛋白形成復合物，最終促使核轉(zhuǎn)錄因子（κB）進入細胞核發(fā)揮調(diào)控作用［12-14］。誘導帕金森病的外界影響因素很多，這類因素可以損傷人腦組織中星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等進而激活釋放 HMGB1［15］，激活的膠質(zhì)細胞或者神經(jīng)元通過旁分泌或自分泌激活HMBGI?TLR4信號，在HMGB1參與的神經(jīng)炎癥研究中發(fā)現(xiàn)HMGB1具有促神經(jīng)炎因子樣作用，腦室內(nèi)注射HMGB1可以促進小鼠腦組織中TNF?α和IL?6的表達，NF?κB作為HMBGI?TLR4信號的下游因子之一，它可以誘導巨噬細胞中白介素6的表達，由于白介素6是一種多效性促炎因子，在慢性炎癥以及神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要的作用，而TNF?α通過NF?κB的誘導活化后也可以參與炎癥反應(yīng)。MyD88通過多種Toll樣受體激活［16-17］，介導白介素6的活化。所以NF?κB、TNF?α、MyD88的表達水平可以反應(yīng)神經(jīng)炎癥水平，以及HMBGI?TLR4軸的表達。

在神經(jīng)炎癥的研究中已經(jīng)有多項報道稱，炎癥因子的水平和病情的發(fā)展具有相關(guān)性，帕金森病雖然是一種中樞退行性的疾病，但是在發(fā)病機制的報道中也存在星形膠質(zhì)細胞過度激活、炎癥因子過度釋放等。而據(jù)以往的報道，HMGB1?TLR4作為中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的核心信號是否與帕金森病發(fā)生發(fā)展具有關(guān)系則未見報道，所以本研究的結(jié)果初步探明了HMBGI?TLR4軸及其下游信號因子在帕金森病的表達異常，從結(jié)果來看，隨著病程的進展，分級的提高，HMGB1?TLR4軸表達水平明顯增高。這可能為臨床中帕金森病分級診斷提供一種標志物的參考。但是本研究從臨床角度出發(fā)，未進行深入的機制研究，所以HMGB1?TLR4軸促進帕金森并進展的機制尚未被揭示，這也是筆者后續(xù)所需要開展的研究。