王竟悟 艾鳳英 王大勝 吳悠 蘇巖杰 楊鑫泉 王大新

1揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科（江蘇揚(yáng)州 225001）；2大連醫(yī)科大學(xué)（遼寧大連 116044）；3中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院（長沙 410011）

血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondins，TSPs）是三聚體調(diào)節(jié)性糖蛋白，是血小板的重要組成部分。近年來，TSPs對心血管系統(tǒng)的作用日益引起大家的關(guān)注。TSPs家族分為兩大類，A亞組包括TSP?1和TSP?2，B亞組包括 TSP?3、?4、?5。研究表明，正常成人組織中TSP?1水平很低，但在動脈粥樣硬化病變處，TSP?1大量表達(dá)，表明其在動脈粥樣硬化性心臟病中起重要作用。而同TSP?1相比，我們對同屬A亞組的TSP?2在動脈粥樣硬化病變中所起到的作用的認(rèn)識受到了明顯限制，其與冠狀動脈動脈粥樣硬化病變程度之間是否具有一定相關(guān)性值得我們進(jìn)行深入的探討。本研究擬分析中國人群血漿TSP?2水平與冠狀動脈狹窄病變程度和相關(guān)炎癥細(xì)胞因子之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月1日至2017年11月30日在蘇北人民醫(yī)院心內(nèi)科206病區(qū)住院并接受冠狀動脈造影檢查的患者，共106例，其中79例確診為冠狀動脈狹窄者為實驗組，男55例，女24例，年齡（62.6±10.89）歲；27例冠狀動脈造影正常者為對照組，男9例，女18例，年齡（58.74±8.78）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞80周歲；既往有明確冠心病病史，行冠脈支架植入或冠脈搭橋術(shù)者；合并CKD病史或急性腎損傷或規(guī)律血液透析者；拒絕行冠脈造影檢查或造影不成功者；心肌炎、心肌病、嚴(yán)重主動脈瓣疾病、外周動脈疾病及結(jié)締組織病者；中、重度心力衰竭；重度或難治性高血壓；良、惡性腫瘤及腫瘤術(shù)后患者；嚴(yán)重心律失常、貧血、感染者；不自愿入組者和心理精神疾病患者。所有研究對象均知情同意，研究符合人體試驗倫理要求。

1.2 冠狀動脈造影檢查 冠狀動脈造影由2位資深的心導(dǎo)管?？漆t(yī)生進(jìn)行，通過Gensini評分（gensini score，GS）分別對左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈等主要冠狀動脈的狹窄程度進(jìn)行評分計算。根據(jù)Gensini評分將實驗組分為輕度狹窄組（Low組，≤12分）共27例，中度狹窄組（Medium組，12～60分）共26例，重度狹窄組（High組，≥ 60分）共26例。

1.3 血漿 TSP?2、MMP?9和 hs?CRP 檢測 所有研究對象均于入院24 h內(nèi)采集5 mL空腹靜脈血于EDTA抗凝管內(nèi)，立即送至江蘇省蘇北人民醫(yī)院實驗研究中心，4℃冰箱靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min；吸取上層淡黃色血漿于1.5 mL EP管中，置-80℃冰箱凍存盒中保存待檢。以酶聯(lián)免疫法（ELISA法）測定各組血漿TSP?2、MMP9、hs?CRP的濃度；TSP?2 ELISA試劑盒購自美國RD公司，MMP9、hs?CRP ELISA試劑盒購自中國上海BG公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0、Graphpad prism 5和EXCEL統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用The Shapiro?Will test來評價計量資料是否符合正態(tài)分布。計數(shù)資料用頻數(shù)、百分構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。計數(shù)資料呈正態(tài)分布且總體方差齊時，則采用獨立樣本t檢驗及單因素方差分析（one?way ANOVA）；若計數(shù)資料不呈正態(tài)分布時，則用 the Mann?WhitneyUtest和 Kruskal?Wallis test.Spearman相關(guān)系數(shù)計算兩個連續(xù)變量之間的關(guān)系；多元逐步回歸分析法用于不同變量對TSP?2的影響評價，并對協(xié)變量進(jìn)行調(diào)整；采用二元Logistic多因素回歸分析冠狀動脈狹窄的危險因素；采用接受器工作特征曲線（ROC曲線）評估診斷價值并計算血漿TSP?2診斷的截斷值。依據(jù)α=0.05的檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料 根據(jù)Gensini評分對106例研究參與者進(jìn)行臨床資料匯總，分析發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白（HDL?C）、脂蛋白A1（ApoA1）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室舒張末內(nèi)徑（LVd）在3組間具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。Gensini評分與總膽固醇（TC）、肌酐、中性粒細(xì)胞百分比、空腹血糖和吸煙百分率呈正相關(guān)（P＜0.05）。各組間年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、血壓、左室收縮末內(nèi)徑（LVs）、左房內(nèi)徑（LA）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL?C）和平均血小板體積等均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 血漿TSP?2水平與Gensini評分的相關(guān)性ELISA法檢測四組人群血漿中TSP?2的水平，血漿中TSP?2水平分別是（15.30±3.58）、（16.81±2.50）、（17.32±3.04）ng/mL，正常組為（13.85±2.39）ng/mL；TSP?2在相鄰兩組組間均不存在差異（P＞0.05）；對照組（control組）與Gensini中評分組（Medium組）開始出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而對照組與Gensini高評分組（High組）相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。線性相關(guān)分析可見血漿TSP?2（r=0.513 4＞0，P＜0.001）水平與Gensini評分之間有顯著的相關(guān)性。見圖1。

表1 對照組與各Gensini評分亞組間臨床基線資料比較Tab.1 Baseline clinical and demographic features according to Gensini score tertiles among patients ±s

對照組組別基線資料人數(shù)（例）年齡（歲）BMI（kg/m2）高脂血癥［例（%）］2型糖尿?。劾?）］收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）吸煙［例（%）］LVEF（%）LVd（mm）LVs（mm）LA（mm）實驗室指標(biāo)TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL?C（mmol/L）HDL?C（mmol/L）LP（a）（mg/L）ApoA1（g/L）空腹血糖（mmol/L）尿酸（μmol/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）中性粒細(xì)胞百分比（%）紅細(xì)胞分布寬度（fL）平均血小板體積（fL）Gensini評分Low組Medium組High組P值27 58.7±8.8 23.2±3.35 5（18.5）3（11.1）132.9±19.8 80.0±11.0 5（19.5）62.0±2.1 45.0±3.6 30.2±2.5 30.8±3.4 27 64.4±8.1 24.0±3.1 5（18.5）5（18.5）137.3±14.3 78.3±9.5 11（40.7）60.0±2.9 46.7±3.1 31.1±2.2 31.9±3.6 26 63.3±11.8 24.1±2.7 6（23.0）11（42.3）136.3±22.7 78.2±10.2 15（57.7）57.8±5.2 46.7±3.7 31.9±4.5 32.5±3.9 26 60.1±12.0 24.3±3.8 6（23.0）10（38.5）147.8±23.0 84.8±14.7 17（65.4）54.8±5.9 48.7±4.5 33.0±4.5 32.0±3.1 0.169 0.613 0.953 0.027*0.074 0.360＜0.01**＜0.01**0.032*0.0857 0.4379 4.4±0.7 1.6±0.8 2.4±0.7 1.3±0.4 227.0±197.2 1.4±0.3 5.5±1.0 313.9±82.1 5.8±1.2 62.3±14.8 62.2±8.7 42.8±2.6 11.1±1.0 4.2±1.0 1.7±1.0 2.4±0.9 1.2±0.3 206.3±197.9 1.3±0.3 6.3±1.9 334.7±107.5 5.9±2.4 75.3±24.6 64.1±8.4 44±4.0 11.3±1.4 4.4±1.2 2.1±1.8 2.4±0.9 1.1±0.4 217.6±183.5 1.2±0.3 6.8±2.3 329.2±64.5 5.9±1.9 81.2±23.0 69.3±8.4 41.6±2.4 11.4±0.9 5.4±2.0 2.3±2.1 3.1±1.5 1.1±0.3 266.5±216.8 1.2±0.3 7.4±3.0 351.1±101.3 5.6±1.5 84.3±20.6 68.5±12.2 43.3±3.3 11.2±1.4＜0.01**0.710 0.129 0.041*0.471＜0.01**0.026*0.772 0.787＜0.01**0.025*0.077 0.763

2.3 血漿TSP?2水平與冠脈狹窄相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性 MMP?9和hs?CRP是目前研究較廣泛的與冠狀動脈狹窄有密切關(guān)系的炎癥細(xì)胞因子，ELISA法在四組人群的血漿中均能檢測到MMP?9和hs?CRP。本實驗結(jié)果同樣也驗證了隨著狹窄程度的上升，血漿MMP?9和hs?CRP的含量也呈上升趨勢，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。相關(guān)性分析顯示血漿TSP?2與MMP?9（r=0.238 5，P=0.013 8）、hs?CRP（r=0.204 2，P=0.035 7）之間具有相關(guān)性（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖1 各組血漿TSP?2水平及TSP?2與Gensini評分的線性相關(guān)分析Fig.1 Plasma TSP?2 levels in each group and linear correlation analysis between TSP?2 and Gensini score

2.4 回歸分析 為確定哪些因素是血漿TSP?2的影響因素，分別以TSP?2為因變量，Gensini評分、年齡、性別、BMI、是否吸煙、LVEF、LVd、LVs、LA、TG、TC、LDL?C、HDL?C、LDL?C、ApoA1、空腹血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、hs?CRP等可能影響血漿TSP?2水平的因素為自變量進(jìn)行多元逐步線性回歸檢測；Gensini評分不符合正態(tài)分布，為確定哪些因素與冠狀動脈狹窄存在關(guān)聯(lián)，對可能響冠狀動脈狹窄Gensini評分的變量做Logstic回歸分析，TSP?2、年齡、性別、是否吸煙、TG、TC、LDL?C、HDL?C、LDL?C、ApoA1、空腹血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、hs?CRP為自變量。結(jié)果如下：以TSP?2為因變量，Gensini評分、LVEF是血漿TSP?2的獨立預(yù)測因子，均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見表3。Logstic回歸分析結(jié)果顯示TSP?2、年齡、hs?CRP是冠狀動脈狹窄病變的獨立危險因素，HDL?C是獨立保護(hù)因素，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表2 對照組與各Gensini評分亞組間血漿MMP?9、hs?CRP水平比較Tab.2 Comparison of plasma MMP?9 and hs?CRP levels between control group and each Gensini score subgroup ±s

表2 對照組與各Gensini評分亞組間血漿MMP?9、hs?CRP水平比較Tab.2 Comparison of plasma MMP?9 and hs?CRP levels between control group and each Gensini score subgroup ±s

注：#，代表與Control比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜ 0.05）；*，代表與Gensini≤ 12比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；※，代表與12＜Gen?sini＜60比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；△，代表與Gensini≥ 60比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）

Gensini評分Control Low組Medium組High組例數(shù)27 27 26 26 MMP?9 8.14 ± 2.0*※△11.16±2.66#△11.09±1.93#△16.53±4.40*#※hs?CRP 43.65 ± 3.42*※△48.18±4.14#△50.17±6.53#△53.28±3.85*#※

表3 以TSP?2為因變量的多元逐步線性回歸Tab.3 Multivariate stepwise linear regression with TSP?2 as dependent variable

2.5 診斷真實性分析（ROC曲線） 將所有研究參與者分為對照組即正常人群組和冠狀動脈狹窄組做接收器工作特征曲線（receiver operator charac?teristic curve，ROC曲線）。曲線的橫軸為“1-特異度”即假陽性率，縱軸“靈敏度”即真陽性率，為反應(yīng)敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合標(biāo)記物。同時，根據(jù)規(guī)定，認(rèn)為AUC范圍在0.5～0.7時，有較低正確性；AUC范圍在0.7～0.9時，有一定正確性；AUC范圍在0.9以上時，正確性較高（即AUC越接近于1，說明診斷效果越好）。結(jié)果如下：TSP?2的AUC為0.742，敏感度為0.532，特異性為0.852，約登指數(shù)為0.383，最佳截斷值為16.17 ng/mL；hs?CRP的AUC為0.845，敏感度為0.759，特異性為0.889，約登指數(shù)為0.648，最佳截斷值47.87 ng/mL。兩者AUC值均＞0.7，P＜0.05，意味著兩者均具有較好的正確性和較好的診斷效果。見表5、圖3。

表4 以冠脈狹窄病變?yōu)橐蜃兞康膌ogistic回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis with coronary stenosis as dependent variable

表5 ROC曲線下面積、靈敏度、特異度、約登指數(shù)和最佳截斷值表Tab.5 The value of the area under the ROC curve，sensitivity，specificity，Youden index and optimal cutoff

圖3 TSP?2和hs?CRP的ROC曲線圖Fig.3 Receiver?operating characteristics（ROC）curve analysis for TSP?2 and hs?CRP

3 討論

近年來隨著對冠狀動脈疾病的病理生理學(xué)研究逐漸深入，直接導(dǎo)致了20世紀(jì)末的人類死亡率的下降［1］。然而，CAD目前仍然是世界上最主要的死亡原因之一［2］。在發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家的35歲以上人群中，1/3的人死于冠狀動脈疾病，而在西方國家，這一比例甚至接近50%［3-4］。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年，全球?qū)⒇?fù)擔(dān)達(dá)到超過4700萬殘障人群［5］。但目前仍然缺乏能夠?qū)跔顒用}病變嚴(yán)重程度進(jìn)行靈敏評估的指標(biāo)。

TSP?2作為一種結(jié)構(gòu)糖蛋白，首先，可通過與CD47的相互作用激活“抗炎”T細(xì)胞，從而阻止內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、凋亡和壞死細(xì)胞的遷移［6-7］。第二，TSP?2能夠調(diào)節(jié)組織炎癥通過限制組織損傷的免疫反應(yīng)，因此，實現(xiàn)一個自適應(yīng)效果［8］。第三，TSP?2可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)活性、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡來抑制血管生成［9］。目前關(guān)于TSP?2的研究成果主要有如下幾個方面［10-11］：（1）血清TSP?2水平與心衰NYHA分級水平具有明顯相關(guān)性；（2）高水平TSP?2是心血管事件發(fā)生的獨立預(yù)測因素；（3）高水平TSP?2聯(lián)合BNP，明顯增加了心血管不良事件的發(fā)生率。可以從上述近年研究成果發(fā)現(xiàn)，對TSP?2的臨床性研究一直集中與心力衰竭方面，TSP?2對心力衰竭終末事件的發(fā)生有良好的預(yù)測作用。因此本研究在人群納入時考慮到心衰的影響，納入的人群均無心力衰竭。同時，筆者目前尚未查閱到TSP?2與冠狀動脈狹窄程度相關(guān)的臨床研究性文章。

本實驗結(jié)果示對照組、輕度狹窄組、中度狹窄組、重度狹窄組的血漿TSP?2含量雖然呈上升趨勢，但組間均不存在差異性（P＞0.05）。中度狹窄組與對照組相比，血漿TSP?2水平出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而CAD終末階段的重度狹窄組與對照組相比，血漿TSP?2水平具有非常顯著的差異性（P＜0.001），可見血漿TSP?2水平對冠脈達(dá)到中、重度狹窄的情況具有較高的預(yù)測效果。對冠狀動脈狹窄病變進(jìn)行Logstic回歸分析和對TSP?2進(jìn)行多元逐步線性回歸結(jié)果也對此也進(jìn)行了佐證，冠狀動脈狹窄程度越大，血漿TSP?2水平越高，而TSP?2又是冠狀動脈狹窄的獨立危險因素。由此可見，在冠狀動脈狹窄逐步加重的過程中TSP?2扮演著一個怎樣的角色值得我們深入的研究。同時，TSP?2的ROC曲線下面積為0.742，與hs?CRP無差異性，具有良好的準(zhǔn)確性，說明TSP?2也是一具有良好臨床應(yīng)用前景的敏感指標(biāo)。

有趣的是多元逐步線性回歸結(jié)果顯示左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與血漿TSP?2水平存在關(guān)聯(lián)性（P＜0.05），SCHROEN等［12］發(fā)現(xiàn)心臟負(fù)荷過重時，心肌纖維化和心臟分泌的某些基質(zhì)可以維持TSP?2一直處于一個高水平狀態(tài)。ALEXANDER等［13］同樣也發(fā)現(xiàn)TSP?2與LVEF存在相關(guān)性。冠狀動脈狹窄是一個緩慢的過程，在這過程中心肌缺血逐漸加重，心臟負(fù)荷也越來越重，心臟結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生一系列的改變，在改變過程中LVEF也會受到影響，同時TSP?2作為血管生成、心肌細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)破壞的必要抑制劑，存在年齡依賴性并調(diào)節(jié)免疫和心血管重塑之間的相互關(guān)系，TSP?2從而和LVEF產(chǎn)生了關(guān)聯(lián)性［14-15］。但本研究為了排除心力衰竭的干擾［11］，只納入了LVEF基本正常的人群，盡管線性回歸分析左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）與血漿TSP?2關(guān)聯(lián)性P=0.046≈0.05，這其中的機(jī)制也值得近一步探討。同時我們也對心臟負(fù)荷早期的指標(biāo)左房內(nèi)徑（LA）進(jìn)行了統(tǒng)計分析，研究結(jié)果表明LA在各組之間無差異性（P＞0.05），在今后的研究中我們?nèi)孕杞Y(jié)合心力衰竭的類型和程度進(jìn)行更廣泛的研究。

炎性細(xì)胞因子一直是動脈粥樣硬化過程中的研究熱點，其可侵蝕不穩(wěn)定斑塊，加重斑塊的易損性［16-17］。CRP是急性時相蛋白，當(dāng)機(jī)體處于一定程度的炎癥反應(yīng)時為陽性，當(dāng)前技術(shù)已可檢測出更準(zhǔn)確、更低的hs?CRP濃度［18］。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也表明TSP?2和hs?CRP存在正相關(guān)性（P＜ 0.05）。同時，在TSP?2和hs?CRP對判斷冠狀動脈的ROC曲線中，筆者發(fā)現(xiàn)TSP?2和hs?CRP的曲線下面積均＞0.7且P＜0.05，對判斷冠狀動脈狹窄有良好的預(yù)測能力?；|(zhì)金屬酶（MMPs）是最常見的一種參與基質(zhì)重塑的酶；除了降解部分基質(zhì)的作用外，MMPs還可以通過從基質(zhì)中釋放生長因子和其它的纖維化信使來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成［19］，且已被證實與冠狀動脈狹窄程度存在顯著相關(guān)性［20］，而MMP?9是基質(zhì)金屬酶中研究最廣泛的。本實驗結(jié)果證實MMP?9與TSP?2之間存在相關(guān)性（P＜0.05）。這也從側(cè)面證實了血漿TSP?2水平與冠狀動脈狹窄程度之間存在關(guān)聯(lián)性。

TSP?1和TSP?2抗血管生成的功能與位于N?末端的裂解素重復(fù)序列有關(guān)［21］。來自該區(qū)域的小肽對血管生成只有微弱的抑制作用，然而，一種特殊的裂解素區(qū)域的七肽分子酸（D-異亮氨酸）被發(fā)現(xiàn)可以使抗血管生成活動增加1 000倍［22］。因而一種有效的抗血管生成的七肽ABT?510產(chǎn)生了［23］。研究表明，ABT?510對人是安全和可耐受的，在Ⅱ期臨床研究中表現(xiàn)出了患者整體存活率有了適當(dāng)延長，聯(lián)合細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行治療能提高抗癌治療的效率，但TSP?1和TSP?2在心血管領(lǐng)域的作用還沒有被開發(fā)出來，在未來極具發(fā)展前景。

綜上所述，血漿TSP?2水平與冠狀動脈狹窄程度之間存在正相關(guān)性，同時也是冠狀動脈狹窄的一個潛在有效的預(yù)測指標(biāo)，結(jié)合其病理生理特點，TSP?2也是今后冠脈狹窄的一個重要治療干預(yù)靶點。同時本實驗最主要的局限性是研究人群數(shù)量較小，同時人群種族、冠脈狹窄評分標(biāo)準(zhǔn)單一、遺傳背景存在差異、樣本量偏小等問題，仍需筆者在今后的研究中更進(jìn)一步的探討。