秦蜀 陳潤 趙曉芳 王勇 向遠彩 羅國松 周虹 代榮陽 張春燕

西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院1肝膽外科，4體檢中心（四川瀘州 646000）；西南醫(yī)科大學2公共衛(wèi)生學院社會醫(yī)學教研室，3肝臟疾病實驗室，5基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室（四川瀘州646000）

轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）屬于與 cAMP反應元件（CRE）結合的C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族［1］。ATF4是一個主要的轉(zhuǎn)錄因子，它的時序性表達和活動處于嚴格的細胞控制之下。ATF4的翻譯受到真核翻譯起始因子2α的調(diào)節(jié)（eIF2α）［2］。在正常情況下，由于半衰期短，ATF4蛋白質(zhì)很快就會被蛋白酶體降解。在應激條件下，eIF2α的磷酸化導致翻譯普遍被抑制，但ATF4 mRNA的翻譯卻顯著上調(diào)［3-4］。ATF4參與多種生物學過程的調(diào)節(jié)，包括細胞氨基酸代謝、成骨細胞分化和氧化應激反應［1，5-7］。體內(nèi)證據(jù)表明ATF4在糖代謝、胰島素敏感性和脂代謝中起著重要作用［8-10］。肝損傷是肝炎、肝硬化、肝癌等多種肝病的共同發(fā)病過程［11］。誘導肝損傷的危險因素很多，如肝炎病毒、酒精、藥物等。雖然已經(jīng)知道應激反應等信號調(diào)控分子可以介導肝臟損傷［12-13］，但肝臟損傷的確切機制仍不清楚。在本實驗研究中，我們觀察到正常小鼠肝臟中應激調(diào)控分子ATF4蛋白呈高水平。CCl4和LPS/D?GalN誘導肝損傷后，肝臟ATF4蛋白水平下降。此外，本研究還證明了CRISPR?Cas9介導的ATF4敲低對CCl4和LPS/D?GalN誘導的小鼠肝損傷有明顯促進作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和抗體 衣霉素購自Tocris（Minneapolis，MN，USA）；CCl4購自國藥（中國，北京）；LPS和D?GalN 購自 Sigma?Aldrich（St.Louis，MO，USA）；ATF4、p?eIF2α 和 Bip抗體 購 自 Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）；eIF2α和 GAPDH抗 體 購 自 Santa Cruz Biotechnology（Heidelberg，Germany）。

1.2 動物及處理 雄性C57BL/6小鼠20～22 g購自南京大學動物模型研究中心（中國，南京，MARC）。本研究中動物的使用已獲單位動物倫理委員會批準，動物倫理批號：20160003。

1.3 質(zhì)粒尾靜脈高壓注射 尾靜脈高壓注射按照文獻［14］報告中所述進行。簡而言之，ATF4靶向的CRISPR?Cas9 質(zhì)?；蚩蛰d體 10 μg稀釋到 2 mL鹽水（0.9%NaCl），經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾，并在5～7 s內(nèi)注入10周大的雄性C57BL/6小鼠的側尾靜脈。

1.4 CCl4肝損傷模型 如前所述，雄性C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射CCl4（4 mL/kg，以5%濃度在橄欖油中溶解），每周3次，共2周［15］。在最后1次注射CCl4后的24 h后處死小鼠，收集肝臟等組織用于實驗。

1.5 LPS/D?GalN肝損傷模型 雄性C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)注射LPS（50 μg/kg）和D?GalN（800 mg/kg），在LPS/D?GalN注射后6 h處死小鼠［16］，收集肝臟等組織用于實驗。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄反應和實時PCR 根據(jù)制造商的說明，用TRIZOL試劑（Invitrogen）分離總RNA。按照制造商說明，使用M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，Madison，WI，USA）進行逆轉(zhuǎn)錄反應。如前所述，采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Tokyo，Japan）進行實時定量PCR分析［15］。使用18S對結果進行標準化。使用的引物如下：小鼠ATF4?forward：TCCTGAACAGCGAAGTGTTG；小鼠 ATF4?reverse：AGAGCT CATCTGGCATGGTT；小鼠 18S?forward：CGGCTACCACATCCAAGGAA；小 鼠 18S?reverse：GCTGGAATTACCGCGGCT。

1.7 Western blot 將小鼠組織溶解到Triton裂解緩沖液中（20 mmol/L Tris、pH 7.4、137 mmol/L Na?Cl、10%glycerol、1%Triton X?100、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L NaF、5 mg/mL抑肽酶、20 mmol/L亮抑酶肽和1 mmol/L原釩酸鈉），4℃離心12 000g15 min。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品在用4×SDS上樣緩沖液（200 mmol/L Tris、pH 6.8，8%SDS、400 mmol/L DTT、0.4%溴酚藍、40%甘油）100℃變性5 min，如前所述進行標準SDS?PAGE和western blot分析［15］。

1.8 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用excel進行錄入整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行分析，對計量資料進行統(tǒng)計描述，兩組間比較采用t檢驗；多組之間比較采用單因素方差分析，對有統(tǒng)計學意義的結果再采用LSD法進行兩兩比較，以上分析均以α=0.05為檢驗水準。結果以±s表達。采用Student′st檢驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肝臟中ATF4蛋白呈高表達 為了研究ATF4在小鼠體內(nèi)的表達情況，我們檢測了ATF4在小鼠肝、心、腎、肺組織中的蛋白和mRNA水平。Western blot結果顯示小鼠肝臟中有明顯的ATF4蛋白表達，而其他組織中幾乎檢測不到ATF4蛋白表達（圖1A）。然而，在上述組織中均能檢測到較高水平的ATF4 mRNA（圖1B）。

圖1 ATF 4蛋白在小鼠肝臟中呈高表達Fig.1 ATF4 proteins are high in mouse liver

2.2 肝臟中ATF4的高蛋白水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激或eIF2α無關 鑒于ATF4的蛋白水平受控于eIF2α，我們通過Western blot分析了小鼠組織中eIF2α的磷酸化水平。結果表明，在檢測的組織中，磷酸化?eIF2α都非常低（圖2A），這提示ATF4在肝臟中的蛋白質(zhì)高水平可能不依賴于eIF2α的磷酸化調(diào)控。為了探明小鼠肝臟ATF4蛋白的高表達是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關，我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑衣霉素處理小鼠。如圖2B所示，衣霉素處理導致了XBP1 mRNA剪接，提示誘導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。其次，我們檢測了衣霉素處理后小鼠肝臟和肺組織中的eIF2α/ATF4信號。結果表明，衣霉素能誘導小鼠肺組織中eIF2α磷酸化、ATF4和Bip蛋白水平的顯著提高（圖2C）。在肝組織中，應用衣霉素后，eIF2α磷酸化和Bip表達相應增強，但是，衣霉素處理后ATF4蛋白卻呈時間依賴性下降（圖2C）。這些結果提示肝臟ATF4蛋白的高水平與eIF2α和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激無關。

圖2 肝臟中ATF4蛋白的高表達不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激或eIF2α調(diào)控Fig.2 Liver ATF4 proteins are not upregulated by ER stress or eIF2α

2.3 CCl4和LPS/D?GalN誘導的小鼠肝損傷中ATF4蛋白質(zhì)水平降低 由于ATF4蛋白在小鼠肝臟中表現(xiàn)出較高的表達水平，且不受經(jīng)典信號調(diào)控。本研究進一步探討了ATF4在肝損傷中的作用。本研究采用CCl4建立慢性肝損傷模型，LPS/D?GalN建立急性肝損傷小鼠模型。Western blot分析表明，在CCl4模型中，小鼠肝臟ATF4蛋白表達顯著下降，然而ATF4的mRNA水平無明顯變化（圖3A、B）。見表1。

表1 CCl4組和對照組肝組織中ATF4 mRNA的表達比較Tab.1 Comparison of ATF4 mRNA expression in liver tissues of CCl4 group and control group

此外，LPS/D?GalN處理6 h后ATF4蛋白也明顯下降（圖3C），而ATF4的mRNA也無明顯變化（圖3D）。見表2。這些結果表明，慢性和急性肝損傷誘導ATF4蛋白質(zhì)降低。

圖3 肝臟ATF4蛋白在肝損傷中降低額度Fig.3 Liver ATF4 proteins were decreased in liver injury

表2 LPS/D?GalN組和對照組肝組織中ATF4 mRNA的表達比較Tab.2 Comparison of ATF4 mRNA expression in LPS/D?GalN group and control group

2.4 抑制ATF4加劇了CCl4和LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷 為進一步探討ATF4對肝臟損傷的影響，我們建立了ATF4靶向的CRISPR?Cas9質(zhì)粒（ATF4?cri），并經(jīng)尾靜脈注射達到下調(diào)ATF4在肝臟中的表達。如圖4A和B中所示，ATF4?cri質(zhì)粒有效地降低了肝臟ATF4的mRNA和蛋白水平的表達。在注射ATF4?cri質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒后，使用CCl4或LPS/D?GalN處理小鼠。血清轉(zhuǎn)氨酶分析顯示，ATF4?cri抑制ATF4后，CCl4肝損傷模型中AST和ALT明顯升高（圖4B）。在LPS/D?GalN模型中獲得了相似的結果（圖4C）。這些數(shù)據(jù)提示ATF4的下調(diào)使小鼠對CCl4和LPS/D?GalN誘導的肝損傷更加敏感，因而ATF4對肝損傷有重要保護作用，見表3、表4。

圖4 ATF4抑制促進了CCl4和LPS/D?GalN誘導的肝損傷Fig.4 Suppression of ATF4 promoted CCl4 and LPS/D?GalN induced liver injury

3 討論

本研究揭示了小鼠體內(nèi)ATF4蛋白質(zhì)和mRNA水平表達模式的特征，首次報道在正常情況下小鼠肝臟中ATF4蛋白保持較高的水平。由于檢測的各組織中ATF4 mRNA水平無差異，故認為在組織中ATF4蛋白的差異表達應該是在翻譯水平或蛋白穩(wěn)定水平。眾所周知，ATF4蛋白通常在應激條件下被上調(diào)，并在應激反應中起著至關重要的作用。多種細胞內(nèi)應激途徑，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，氨基酸不足和氧化應激都可以誘導eIF2α的磷酸化，這導致了蛋白質(zhì)合成的普遍抑制，而ATF4 mRNA翻譯反而上調(diào)［3］。本研究觀察到ATF4蛋白在小鼠肝臟中呈高水平，而在其他組織中卻幾乎檢測不到。然而在檢查的組織中eIF2α磷酸化水平均呈現(xiàn)一致的低水平，這與肝臟中ATF4蛋白的高水平不一致。故認為肝臟ATF4蛋白高水平與eIF2α無關。為了證實這一推測，我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑衣霉素來觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和eIF2α磷酸化。衣霉素在小鼠肝臟和肺臟誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過剪接的XBP1 mRNA、Bip蛋白的增加和eIF2α磷酸化得到了證實。小鼠肺臟中被衣霉素持續(xù)誘導的ATF4蛋白提示肺臟中ATF4受到eIF2α的經(jīng)典調(diào)節(jié)。然而，在衣霉素處理后，肝臟中ATF4蛋白下降，這表明ATF4蛋白在肝組織中有一種與eIF2α無關的特殊調(diào)節(jié)模式。另一個可能的機制是ATF4的穩(wěn)定性在肝臟和其他組織中是不同的。據(jù)報道，ATF4的降解是由E3泛素連接SCFβTrCP介導的。另有報告表明，P300調(diào)節(jié)了ATF4的穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄活性。ATF4的穩(wěn)定性是否會導致組織中ATF4蛋白水平的差異需要進一步的研究。

表3 ATF4對CCl4誘發(fā)的肝損傷（ALT，AST）的影響Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by CCl4±s

表3 ATF4對CCl4誘發(fā)的肝損傷（ALT，AST）的影響Tab.3 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by CCl4±s

注：a表示與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；b表示與ATF4?cri對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；c表示與CCl4組比較差異有統(tǒng)計學意義；d表示與ATF4?cri+CCl4組比較差異有統(tǒng)計學意義

組別空白對照組ATF4?cri對照組CCl4組ATF4?cri+CCl4組F值P值ALT 53.2±11.8cd 91.2±58.0cd 2 602.3±1103.7abd 4 358.6±2192.0abc 17.469＜0.001 AST 254.8±110.0cd 195.7±49.4cd 1 245.8±672.9abd 2 516.4±672.9abc 13.264＜0.001

表4 ATF4對LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷（ALT，AST）的影響Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by LPS/D?GalN ± s

表4 ATF4對LPS/D?GalN誘發(fā)的肝損傷（ALT，AST）的影響Tab.4 Effects of ATF4 on liver injury（ALT,AST）induced by LPS/D?GalN ± s

注：a表示與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；b表示與ATF4?cri對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；c表示與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義；d表示與ATF4?cri+LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義

組別空白對照組ATF4?cri對照組LPS組ATF4?cri+LPS 組F值P值ALT 102.7±22.32cd 124.83±14.6cd 2451.0±846.5abd 7777.8±3587.0abc 23.083＜0.001 AST 57.7±21.8cd 71.3±20.9cd 3081.7±1193.3abd 13948.2±4160.7abc 55.699＜0.001

本研究的目的是探索小鼠肝臟中ATF4蛋白表達的高水平是否暗示其在肝臟中的重要作用。據(jù)報道［17］，ATF4突變可導致嚴重的胎兒貧血和胎兒肝臟發(fā)育不全。另外有報道表明ATF4在肝臟脂質(zhì)代謝中起著重要的作用［8-11］。肝損傷是導致侵襲性肝臟疾病最常見的肝損害。本研究中，我們采用CCl4介導的慢性肝損傷模型和LPS/D?GalN誘導的急性肝損傷模型，探討了ATF4在肝損傷中的作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在使用CCl4和LPS/D?GalN后，小鼠肝臟中的ATF4蛋白明顯降低，而mRNA無明顯變化?，F(xiàn)在的問題是，ATF4的降低在肝臟損傷中是否發(fā)揮了作用。本實驗結果表明，Crisper對ATF4的敲低作用明顯加重了CCl4和LPS/D?GalN所致的肝損傷，表現(xiàn)為血清AST和ALT進一步升高。這些結果提示ATF4在肝損傷中具有保護作用。在以往的研究中，ATF4被認為是正常細胞增殖的關鍵，尤其是對于胎肝造血時期所需的高水平增殖［17］。肝臟是一個再生能力極強的組織，肝細胞能夠在肝臟損傷反應中增殖，以恢復其功能。在使用CCl4和LPS/D?GalN處理后的模型中，需要高水平的細胞增殖協(xié)助肝臟功能的恢復。因此，我們的結果的一個可能的解釋是ATF4的缺乏抑制了肝修復反應中的細胞代償增殖，從而導致了更嚴重的肝損傷。ATF4的下調(diào)促進肝損傷的詳細機制有待進一步研究闡明。

總之，本研究揭示了ATF4蛋白在小鼠肝臟中的表達不依賴于經(jīng)典調(diào)控模式。化學劑誘導的肝損傷可引起肝臟中ATF4蛋白的下調(diào)，ATF4的下調(diào)促進了CCl4和LPS/D?GalN誘導的肝損傷。