范武 于雪峰 任向楠 陳凱云

1南昌大學(xué)（南昌 330003）；2南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院（南昌 330003）；3清華大學(xué)生命有機(jī)磷化學(xué)及化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室（北京100084）

臨床上部分患者因自身免疫性疾病等需要長期或過量使用糖皮質(zhì)激素，導(dǎo)致激素性股骨頭壞死（steroid?associated necrosis of the femoral herd，SANFH）的患病人數(shù)不斷增加，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前關(guān)于SANFH的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但有研究表明［1-3］脂質(zhì)代謝紊亂為其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，過量激素的使用會造成大量的脂肪分解產(chǎn)物被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，引起機(jī)體內(nèi)血脂水平升高，血液變得黏稠，導(dǎo)致髓內(nèi)的微型血管出現(xiàn)栓塞［4-5］，同時會誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞堆積在髓腔，壓迫腔內(nèi)血管，造成股骨頭缺血壞死［2，6］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭壞死當(dāng)屬“骨痹”“骨蝕”“血瘀”等范疇，其主要病因為瘀血阻滯、經(jīng)脈不通，因此臨床上常應(yīng)用活血化瘀、補腎壯骨的方法治療股骨頭壞死，療效確切，但有關(guān)激素誘發(fā)股骨頭壞死的早期中藥預(yù)防作用及機(jī)制的報道較少。本實驗通過建立激素誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死模型，運用具有活血補氣、補腎壯骨功效的中藥復(fù)方骨蝕靈膠囊進(jìn)行干預(yù)治療，觀察動物模型中的血脂水平改變特點及股骨頭組織形態(tài)影像學(xué)變化，探究其可能的預(yù)防股骨頭壞死的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年健康日本大耳白兔48只，體質(zhì)量為（2.5± 0.3）kg，雌雄各半，實驗兔子單獨分籠、顆粒飼料喂養(yǎng)，由清華大學(xué)動物實驗中心提供并在此完成實驗，環(huán)境溫度為20～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 藥物及試劑 藥物：骨蝕靈膠囊，0.27 g/粒，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠；醋酸潑尼松龍，125 mg/5 mL，購于浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H33020824；洛伐他汀片，20 mg/片，購于北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H10970092；青霉素鈉，80萬U/支，購于華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020657。試劑：2700全自動生化分析儀Olympus配套的生化檢測試劑。

1.3 分組 48只實驗兔，耳緣靜脈采血后血清血脂生化檢查差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組：對照組、模型組、骨蝕靈膠囊組、洛伐他汀組，每組12只。

1.4 造模和干預(yù)方法

1.4.1 造模 對照組在左側(cè)臀部肌肉注射生理鹽水，1 mL/只，每周2次，連續(xù)4周。其余3組每只兔子均在左側(cè)臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍注射液（10 mg/kg），1 mL/只，每周2次，連續(xù)4周。

1.4.2 干預(yù)方法 對照組：蒸餾水空腹灌胃15 mL，每日1次，連續(xù)4周。模型組：蒸餾水空腹灌胃15 mL，每日1次，連續(xù)4周。骨蝕靈膠囊組：骨蝕靈膠囊粉末，用蒸餾水調(diào)成90 mg/mL濃度的混懸液15 mL，空腹灌胃，每日1次，連續(xù)4周。洛伐他汀組：洛伐他汀片，磨成粉末后用蒸餾水調(diào)成200 μg/mL濃度的混懸液，15 mL，空腹灌胃，每日1次，連續(xù)4周。藥物使用量均按人與兔體表面積換算公式計算。

1.5 主要設(shè)備和儀器 2700全自動生化分析儀：Olympus；200倍光學(xué)顯微鏡：Olympus；磁共振掃描儀：Philips 3.0T Achieve TX。

1.6 血清脂質(zhì)生化檢查 分別在第2、4周時間節(jié)點，各組均使用采血管從動物同一部位的耳緣靜脈采血3 mL，室溫靜置4 h后離心（4 000 r/min，時間10 min），取上清液并使用全自動生化分析儀測定各組的總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的血清水平。

1.7 MRI檢查 第4周，各組選取2只兔子在核磁檢測前用1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）靜脈注射使動物鎮(zhèn)靜，核磁成像在清華大學(xué)生物影像中心完成，使用Philips 3.0T Achieve TX儀器進(jìn)行雙側(cè)股骨頭核磁掃描成像。

1.8 股骨頭形態(tài)學(xué)檢查 分別在第2、4周時間節(jié)點各組隨機(jī)選取3只兔子，使用20 mL注射器進(jìn)行空氣栓塞法處死后，迅速取出雙側(cè)股骨頭組織，在清潔干凈的冰浴手術(shù)盤中用生理鹽水進(jìn)行沖洗干凈，放入10%福爾馬林溶液中固定脫鈣，按照蘇木精-伊紅染色（HE）染色切片要求浸蠟包埋并切片觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本次實驗中獲得的血清脂質(zhì)水平數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并使用Graph Pad Prism 5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 第2周和第4周時各組的血清脂質(zhì)檢測結(jié)果 生化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余3組在第2周時的血清脂質(zhì)均出現(xiàn)明顯代謝紊亂，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；第4周時，與模型組相比，骨蝕靈膠囊組和洛伐他汀組的TC、TG以及LDL水平明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、2。

表1 2周時各組兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比較Tab.1 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 2 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

2.2 各組兔股骨頭HE染色的光鏡檢查結(jié)果 4周對照組：空骨陷窩少，骨小梁粗大完整，未見排列紊亂，骨細(xì)胞形態(tài)完好，無嗜酸性粒細(xì)胞聚集和脂肪細(xì)胞增生（圖1A）；4周模型組：骨小梁纖細(xì)和斷裂，走形紊亂，大量骨細(xì)胞出現(xiàn)萎縮變小，空骨陷窩增多，骨髓腔內(nèi)可見脂肪滴堆積及大量的嗜酸性粒細(xì)胞聚集（圖1B）；4周骨蝕靈膠囊組：骨小梁走形和結(jié)構(gòu)改善，空骨陷窩增多，骨髓腔可見少量嗜酸性粒細(xì)胞，未見脂肪細(xì)胞增生（圖1C）；4周洛伐他汀組：骨小梁走形和結(jié)構(gòu)改善，空骨陷窩增多，骨髓腔可見少量脂肪細(xì)胞增生及少量嗜酸性粒細(xì)胞（圖1D）。

表2 4周時各組兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比較Tab.2 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 4 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

圖1 第4周時各組股骨頭HE染色結(jié)果（×200）Fig.1 Results of HE staining of the femoral heads in the each group at fourth weeks（× 200）

2.3 MRI檢查結(jié)果 對照組：T1加權(quán)（T1WI）、T2加權(quán)（T2WI）模式顯示雙側(cè)股骨頭表面光滑，形態(tài)規(guī)則，股骨頭內(nèi)部無異常信號改變，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙正常（圖2）。模型組：雙側(cè)股骨頭骺線模糊，股骨頭表面不均勻，形態(tài)欠規(guī)則，股骨頭內(nèi)部出現(xiàn)片狀不規(guī)則的長T1短T2改變區(qū)域，T2WI提示雙側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙增寬，關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體增多，雙側(cè)軟組織肌肉間隙液體增多（圖3）。骨蝕靈膠囊組：可見雙側(cè)股骨頭頭下無異常信號帶，關(guān)節(jié)間隙正常，腔內(nèi)及周圍軟組織積液減少（圖4）。洛伐他汀組：雙側(cè)股骨頭骺線稍模糊，頭下無異常信號改變，關(guān)節(jié)間隙正常，腔內(nèi)及周圍軟組織積液減少（圖5）。

圖2 對照組兔子雙側(cè)股骨頭核磁共振成像Fig.2 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the control group

3 討論

圖3 模型組兔子雙側(cè)股骨頭核磁共振成像Fig.3 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the model group

圖4 骨蝕靈組兔子雙側(cè)股骨頭核磁共振成像Fig.4 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the Gushiling Capsule group

SANFH后期造成的骨關(guān)節(jié)炎癥會對患者造成嚴(yán)重后果，甚至?xí)?dǎo)致患者喪失勞動能力，因此早期診斷股骨頭壞死并提前預(yù)防顯得非常重要［7］。臨床上股骨頭缺血壞死患者的早期發(fā)現(xiàn)主要靠核磁共振檢測［8］，但股骨頭內(nèi)部的病理改變包括骨小梁纖細(xì)斷裂和脂肪細(xì)胞增生堆積等骨壞死變化早在MRI檢測出SANFH信號改變前就已經(jīng)出現(xiàn)［9］，所以往往會降低早期的防治效果，影響患者的生存質(zhì)量。大量研究表明激素是導(dǎo)致股骨頭壞死的主要原因［10-11］，而其主要是通過擾亂機(jī)體正常的脂質(zhì)代謝而導(dǎo)致股骨頭缺血壞死［12-13］。激素可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)高脂血癥［14-15］，長期使用激素可以抑制肝脂肪酶的活性并導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)脂肪分解大于脂肪合成，造成大量的脂肪分解產(chǎn)物釋放進(jìn)入血液循環(huán)，從而導(dǎo)致血清脂質(zhì)水平增高，主要表現(xiàn)為TC、TG以及LDL升高以及HDL降低，使血液黏稠度增加，容易在股骨頭微循環(huán)中形成栓子，引起股骨頭微循環(huán)栓塞，造成其供血區(qū)域的股骨頭缺血壞死［16-19］。同時，骨髓基質(zhì)細(xì)胞在激素的作用下向脂肪細(xì)胞分化增多，脂肪堆積等病理改變，是激素誘導(dǎo)股骨頭發(fā)生壞死的重要病理基礎(chǔ)［20］，而骨髓腔內(nèi)的空間有限，脂肪堆積將引起骨內(nèi)壓持續(xù)增高，股骨頭內(nèi)的微小血管受到壓迫，加劇股骨頭缺血，引起股骨頭缺血壞死。臨床上發(fā)現(xiàn)他汀類降脂藥物可通過降低體內(nèi)血清脂質(zhì)水平有效預(yù)防激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死亦證明這一觀點［21］。因此，在器官移植，治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肌無力等需要長期或過量使用糖皮質(zhì)激素時［10，22-23］，盡早給予藥物干預(yù)，改善機(jī)體的脂質(zhì)紊亂，防止股骨頭組織進(jìn)一步的病理改變，才可以達(dá)到預(yù)防股骨頭壞死的目的。

圖5 洛伐他汀組兔子雙側(cè)股骨頭核磁共振成像Fig.5 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the lovastatin group

國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SANFH患者體內(nèi)的TC、LDL水平均顯著高于正常水平，用Logistic多因素回歸分析顯示，TC和LDL是導(dǎo)致股骨頭壞死的獨立危險因素［15，24］。本實驗病理切片觀察到4周時模型組股骨頭組織中出現(xiàn)骨小梁纖細(xì)、斷裂、排列紊亂，骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪滴堆積，在脂肪空泡間可發(fā)現(xiàn)豐富的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤等股骨頭壞死病理改變。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病多因患者素體腎氣虧虛，復(fù)由服用激素而發(fā)。病機(jī)關(guān)鍵為瘀血阻滯，筋骨失養(yǎng)，髓海瘀滯。因而其治則為活血化瘀、通絡(luò)，行氣止痛。近年來越來越多的學(xué)者通過發(fā)掘中醫(yī)藥的巨大寶藏，就中醫(yī)藥治療SANFH的相關(guān)方面進(jìn)行了許多研究［12］，目前臨床將其分為氣滯血瘀型、風(fēng)寒濕痹型、痰濕型、氣血虛弱型、肝腎不足型。而中藥復(fù)方骨蝕靈膠囊由丹參、白芍桃仁、紅花、川芎、土鱉蟲、自然銅、乳香、沒藥、香附、木香、牛膝等組成，具有益氣活血、補腎壯骨之功效，主要用于治療氣滯血瘀型SANFH。方以丹參、白芍為君，其中丹參活血調(diào)經(jīng)，涼血消癰，安神；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰，緩急止痛，二藥共奏活血化瘀，斂陰止痛之功效，有研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可通過降低TC含量，抑制LDL水平，及時清掃多余的膽固醇，有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平［25］。諸藥相輔相成，以活血化瘀，通絡(luò)行氣，斂陰止痛為主，兼以補肝腎，續(xù)筋接骨。正合中醫(yī)骨傷科“瘀祛”、“新生”、“骨合”的理論。本實驗通過檢測各組動物模型第2周時的血清脂質(zhì)水平，發(fā)現(xiàn)激素均可導(dǎo)致TC、TG、LDL血清水平顯著升高（P＜0.01），且HDL水平顯著降低（P＜0.01）。第4周時，骨蝕靈膠囊組及洛伐他汀組與模型組相比，可顯著降低血清TC、TG、LDL水平。同期的動物模型的核磁檢測結(jié)果提示：模型組的股骨頭形態(tài)出現(xiàn)異常，頭下出現(xiàn)異常的信號改變帶，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)間隙增寬，及關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體增多，雙側(cè)軟組織肌肉間隙液體明顯增多。骨蝕靈膠囊組和洛伐他汀組的病理切片顯示其股骨頭內(nèi)部的骨小梁的結(jié)構(gòu)和脂肪細(xì)胞增生肥大等組織病理情況均比模型組要改善，同期的核磁檢測結(jié)果呈相應(yīng)改變，且骨蝕靈膠囊組的股骨頭組織病變程度最輕，考慮為骨蝕靈膠囊的改善股骨頭壞死作用和血脂調(diào)節(jié)能力優(yōu)于洛伐他汀，具體原因有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本實驗選取了血清脂質(zhì)中TC、TG、HDL和LDL 4個脂質(zhì)檢測指標(biāo)研究骨蝕靈膠囊治療SAN?FH的作用，實驗結(jié)果表明上述4個血清脂質(zhì)指標(biāo)早期均出現(xiàn)代謝紊亂狀態(tài)，中藥骨蝕靈膠囊及西藥洛伐他汀可通過改善早期激素誘導(dǎo)的血清脂質(zhì)代謝紊亂，從而達(dá)到防治股骨頭壞死的作用，且中藥復(fù)方由于整合作用強及多靶點、毒副作用小更具有優(yōu)勢。本次實驗僅選取SANFH復(fù)雜的脂質(zhì)代謝環(huán)節(jié)中的幾種脂質(zhì)檢測指標(biāo)，檢測靶點有待進(jìn)一步拓展，其深入的分子機(jī)制將是下一步的研究重點。