肖斌 莊玉格 侯賢德 劉萍 陳建蕓 孫朝暉 李林海

1中國人民解放軍廣州總醫(yī)院檢驗科（廣州 510010）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗系（廣州 510515）

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其組織形態(tài)復(fù)雜，種類繁多，而且乳腺癌的發(fā)病機制目前也尚未完全闡明。據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計［1］，2008年全世界新發(fā)乳腺癌病例138萬，占癌癥死亡總數(shù)的23%，死于乳腺癌的有45.8萬，占癌癥死亡總數(shù)的14%。近些年來，我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響著患者的身心健康［2］。因此，極有必要深入地探討乳腺癌的發(fā)病機制。BLNK基因編碼的B細胞連接蛋白是一種接頭蛋白，在B細胞受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，其SH2結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)構(gòu)域能分別與其上下游信號蛋白的特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，實現(xiàn)上下游的信號傳遞，從而調(diào)節(jié)B淋巴細胞的增殖、分化、凋亡等進程；在B細胞受體信號通路過度活躍的條件下，B細胞的正常分化和凋亡可被抑制，導(dǎo)致B細胞異常增殖，且BCR信號通路的一部分酶可以引發(fā)染色體易位，致使免疫球蛋白基因位點發(fā)生改變，形成癌基因［3-7］。近年來圍繞BLNK開展的疾病研究多集中于血液系統(tǒng)腫瘤和淋巴瘤，而研究顯示BLNK在不同腫瘤中的生物學(xué)作用截然不同。2016年，MARCOTTE等［8］在《Cell》上首先報道了BLNK在乳腺癌中的功能。該課題組利用全基因組shRNA篩選技術(shù)在17種乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)BLNK是一種乳腺癌驅(qū)動基因（driver gene）。而多項研究以及本課題組的前期結(jié)果（未發(fā)表）也顯示：BLNK高表達于乳腺癌細胞，并顯著促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其過表達可能是造成乳腺癌發(fā)生的重要因素［9-11］，但BLNK影響乳腺癌細胞發(fā)生發(fā)展的具體機制依然有待考證。本研究構(gòu)建了人BLNK基因慢病毒載體，包裝病毒后感染并篩選了穩(wěn)定表達BLNK的人乳腺癌MDA?MB?231細胞株，為進一步探討B(tài)LNK在乳腺癌中的生物學(xué)作用提供有效的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料 非病毒質(zhì)粒3XFlag?BLNK、293T細胞系、MDA?MB?231細胞、慢病毒載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒pMD2.G及包裝質(zhì)粒psPAX2由本實驗室保存；DNA maker購自Takara公司（Cat：3427Q）；總RNA提取試劑（Cat：ER101?01）及 qPCR 試劑（Cat：AQ141?01）購自北京全式金公司；LipofectamineTM2000購自Thermo Fisher（Cat：11668027）；凝膠純化試劑盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；ECL Western blotting試劑盒購自Thermo Fisher（Cat：WP20005）；DAPI染液購自碧云天（Cat：C1002）。

1.2 重組慢病毒BLNK過表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.2.1 BLNK基因片段的PCR擴增 用之前構(gòu)建好的非病毒質(zhì)粒3XFlag?BLNK為模板，進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠純化后回收備用。

1.2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR產(chǎn)物與慢病毒載體進行常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化、挑菌等分子克隆實驗，重組質(zhì)粒并送華大基因測序鑒定。

1.3 BLNK慢病毒的包裝 轉(zhuǎn)染前1 d在10 cm平皿中接種293T包裝細胞，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；包裝細胞50%融合時共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表達載體載體各4 μg，以及30 μL標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000，同時設(shè)置慢病毒空載體FLAG?vector作為陰性對照；6 h后換液，加入10 mL的新鮮培養(yǎng)基；48 h后培養(yǎng)上清用0.45 μm的非硝酸纖維濾器消毒過濾，以清除細胞碎屑及污染的包裝細胞，4℃暫時保存，-80℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 穩(wěn)定表達BLNK細胞系的建立與鑒定 感染前1 d（18 ～ 24 h），MDA?MB?231細胞鋪板（10 cm）；50%融合，10 mL的含病毒上清液加入8 μg/mL的Polybrene（已配成1 000×工作液）；6 h后更換正常培養(yǎng)基10%FBS的DMEM；24 h后開始用濃度0.5 μg/mL puro篩選；每1～2天更換培養(yǎng)基（均含相同puro濃度，根據(jù)細胞死亡情況，調(diào)整puro濃度）；約1周后可挑選出穩(wěn)定細胞株，獲得的細胞即為BLNK MDA?MB?231細胞和 miR?vector MDA?MB?231細胞，在高倍鏡100×視野下觀察被感染細胞數(shù)及細胞狀態(tài)，在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的熒光表達情況。

將感染后的細胞BLNK MDA?MB?231細胞和miR?vector MDA?MB?231細胞按5 × 10個/孔接種于6孔板完全培養(yǎng)基中，孵育24 h后，利用Trizol法提取細胞總RNA，采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT?PCR方法檢測兩組細胞中BLNK基因表達的情況。

1.5 Western blotting檢測BLNK的表達 RIPA裂解液提取細胞總蛋白質(zhì)，按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書操作測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品進行SDS?PAGE，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，用50 g/L脫脂牛奶37℃封閉1 h，加以50 g/L脫脂牛奶1∶1 000稀釋的抗人BLNK抗體（Abcam，Cat：ab32418），4℃過夜，TBS?T洗膜后，加以50 g/L脫脂牛奶1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，37℃溫育1 h，TBS?T洗膜，ECL液顯影［12］，GADPH作為內(nèi)參蛋白定量。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增人BLNK基因片段 以質(zhì)粒3×Flag?BLNK為模板，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物大小約為1 368 bp，與BLNK基因的理論大小一致（圖1）。

2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將重組慢病毒質(zhì)粒送至華大公司測序驗證，經(jīng)序列比對后證實插入序列無誤，表明重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 BLNK慢病毒的包裝 BLNK慢病毒載體表達質(zhì)粒和慢病毒空載體質(zhì)粒FLAG?vector與包裝病毒系統(tǒng)質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染1周后收集上清液病毒顆粒。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR product after amplification

2.4 穩(wěn)定表達BLNK細胞系的建立與鑒定 熒光顯微鏡觀察到BLNK?MDA?MB?231細胞和Vector?MDA?MB?231細胞均帶有綠色熒光（圖2），且病毒所在位置與細胞核位置基本重合，表明重組慢病毒已成功感染了人乳腺癌MDA?MB?231細胞。重組細胞傳代后，在100×顯微鏡下可觀察到重組細胞生長情況與對照細胞基本一致，狀態(tài)良好（圖3）。

圖2 重組慢病毒感染MDA?MB?231細胞后的熒光圖Fig.2 The Fluorescent result of recombinant lentivirus infection of MDA?MB?231 cell

圖3 慢病毒感染傳代后的細胞形態(tài)100×Fig.3 The cell morphology after passage of lentivius infection

2.5 RT?qPCR和Western Blotting檢測BLNK基因的表達 采用RT?qPCR和Western Blotting檢測重組細胞和對照細胞中BLNK基因的表達情況。結(jié)果表明，與對照細胞相比，重組細胞中BLNK基因的mRNA水平及蛋白表達水平均明顯升高，提示穩(wěn)定表達BLNK的細胞系已構(gòu)建成功（圖4）。

3 討論

BLNK是B細胞特異性的銜接蛋白［4］。BLNK的基本結(jié)構(gòu)包括N末端的亮氨酸鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)（leucine zipper motif）、脯氨酸富集區(qū)（proline?rich region）和C末端的SH2結(jié)構(gòu)域（C?terminal SH2 domain）［13-14］。作為BCR與下游信號通路的連接蛋白，BLNK為BTK和PLC?γ2提供結(jié)合位點，以調(diào)節(jié)信號通路中下游蛋白的活性［15］。B細胞受體信號通路過度活躍，可以抑制B細胞的正常分化和凋亡，促進異常增殖［7］，而BCR信號通路的部分酶會引起染色體易位從而改變免疫球蛋白基因位點，形成致癌基因［5］。BCR與周圍環(huán)境中的抗原結(jié)合后觸發(fā)BCR介導(dǎo)的信號通路，使酪氨酸激酶和一些小分子發(fā)生突變，從而促使腫瘤細胞的形成［5］。已有研究表明BLNK能促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［11，16］，其過表達可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，但具體的關(guān)系尚不明確。

圖4 BLNK在重組細胞中的表達Fig.4 The expression of BLNK in recombinant cell

慢病毒載體包含有包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定和整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的重要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒和293T細胞的協(xié)助作用下，被包裝成有感染力的病毒顆粒，通過感染目的細胞，實現(xiàn)外源基因在目的細胞中的表達［17］。與真核表達質(zhì)粒相比，重組慢病毒技術(shù)的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性顯著提高［18］。

為提高基因轉(zhuǎn)染效率，本研究選擇將3XFlag?BLNK基因插入慢病毒表達載體，構(gòu)建重組慢病毒載體，與慢病毒包裝質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染293T細胞，在細胞中進行病毒包裝。用包裝好的慢病毒顆粒感染人乳腺癌MDA?MB?231細胞，經(jīng)過GFP篩選，建立MDA?MB?231慢病毒細胞株，且慢病毒顆粒感染后的MDA?MB?231細胞中BLNK穩(wěn)定高表達，提示已成功運用該載體將BLNK基因整合入MDA?MB?231細胞的基因組中。

本研究成功地構(gòu)建了BLNK穩(wěn)定表達的乳腺癌細胞株，為從細胞和分子水平上探討B(tài)LNK基因?qū)θ橄侔┘毎恼{(diào)控作用提供了體外細胞系模型，為進一步明確乳腺癌的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制奠定了基礎(chǔ)。