張艷波 戚孟春 董偉 張廣峰 馮曉潔 溫黎明 孫紅

華北理工大學(xué)1口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室（河北唐山 063000）

破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一骨吸收的細(xì)胞，與許多疾病的骨吸收有關(guān)［1?3］?；罨疶細(xì)胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，Ca2+/Calmodulin/NFATc1）信號通路在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用；而鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（Ca2+/Calmodulin dependent kinases，CaMKs）是鈣信號軸中傳遞鈣信號的重要分子［4?6］。研究顯示，CaMKII作為CaMKs家族中成員，其δ亞型（CaM?KIIδ）在破骨細(xì)胞分化過程中持續(xù)高表達(dá)［7?8］，提示其可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其作用及機制目前尚不清楚。本實驗通過構(gòu)建小鼠CaMKIIδ過表達(dá)慢病毒載體，探索其過表達(dá)對破骨細(xì)胞分化及骨吸收的影響，以進(jìn)一步揭示CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 RAW264.7細(xì)胞（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；小鼠核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activatior of nuclear factor κB ligand，RANKL），美國Peprotech公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，以色列Biological industries公司；TRAP染色試劑盒，美國Sigma公司；CaMKIIδ抗體，美國Santa cruz公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒，日本TAKARA公司；引物由上海生工公司合成。

1.2 破骨細(xì)胞分化中CaMKIIδ高轉(zhuǎn)錄本的篩選經(jīng)GeneBank檢索，小鼠CaMKIIδ共有7個轉(zhuǎn)錄本；為了確定過表達(dá)載體所采用的序列，針對上述7個轉(zhuǎn)錄本設(shè)計引物（表1），通過RT?PCR確定在破骨細(xì)胞分中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，用于過表達(dá)載體構(gòu)建。

RAW264.7細(xì)胞以2×104個/cm2密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，24 h后加入50 ng/mL RANKL向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)；于誘導(dǎo)第0、1、3、5 d收獲細(xì)胞，Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PCR擴增；反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min；擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 CaMKIIδ基因7種轉(zhuǎn)錄本引物設(shè)計Tab.1 Primers of different transcription variants of CaMKIIδ used in RT?PCR

1.3 CaMKIIδ重組載體構(gòu)建 針對實驗1.2中篩選出的CaMKIIδ高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（轉(zhuǎn)錄本2），應(yīng)用攜帶增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒進(jìn)行過表達(dá)載體構(gòu)建。在最佳MOI（multiplicity of infec?tion）=30［9］條件下應(yīng)用空載體及重組載體分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，72 h后用4 μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，共處理4 d。

1.4 重組CaMKIIδ在細(xì)胞中的表達(dá)檢測 RAW 264.7細(xì)胞分為三組：對照組、空載體組、CaMKIIδ過表達(dá)組。對照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染；后兩組分別為轉(zhuǎn)染空載體及重組載體的第三代穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；細(xì)胞培養(yǎng)3 d后進(jìn)行檢測。

Real?time PCR 檢測：Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在QuantStudioTM6 Flex實時熒光定量PCR儀上檢測；反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃15 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所用引物為：CaMKIIδ轉(zhuǎn)錄本 2，上游 5′?CAGTGGTGAGAA?GATGTATG?3′，下游5′?TTCAAGAGACGGCAGATT?3′，產(chǎn)物130 bp；β?actin，上游5′?GACGTTGACATC?CGTAAA?3′，下游 5′?AGCAGTAATCTCCTTCTG?3?，產(chǎn)物102 bp。

Western blot檢測：提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度；5×蛋白上樣緩沖液稀釋，煮沸、變性、轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉1 h；兔抗鼠一抗4℃過夜，羊抗兔二抗37 ℃ 0.5 h，ECL（Enhanced chemiluminescence）顯色1 min。經(jīng)Image?pro plus 6.0軟件分析蛋白條帶積分光密度值（IOD）；以β?actin為內(nèi)參。目的蛋白條帶IOD值與β?actin條帶IOD值的比值代表目的蛋白相對水平；實驗重復(fù)3次。

1.5 CaMKIIδ過表達(dá)對破骨細(xì)胞分化及功能的影響 實驗分組同實驗1.4。細(xì)胞接種同實驗1.2，采用100 ng/mL RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)分化。TRAP染色：誘導(dǎo)5 d后，收獲細(xì)胞并按照試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色，200倍顯微鏡下觀察。每張細(xì)胞爬片隨機取6個視野，計算TRAP+且胞核≥3個的細(xì)胞數(shù)目，取其平均值；每組測量5個細(xì)胞爬片［10］。吸收陷窩檢測：制備0.2 mm厚牙本質(zhì)磨片并接種細(xì)胞；誘導(dǎo)14 d后收獲細(xì)胞，500倍下掃描電鏡（SEM）選取6個視野，檢測每個視野吸收陷窩數(shù)目及面積，取平均值；每組檢測5個質(zhì)磨片［10］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 17.0軟件對各組參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CaMKIIδ高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本篩選 破骨細(xì)胞分化不同時間點CaMKIIδ各轉(zhuǎn)錄本PCR產(chǎn)物電泳條帶見圖1。條帶1、9、13分別代表轉(zhuǎn)錄本1、5、7，有微弱條帶出現(xiàn)，提示這3個轉(zhuǎn)錄本表達(dá)較弱；條帶7、11分別代表轉(zhuǎn)錄本4、6，無條帶出現(xiàn)，提示無表達(dá)；條帶3、5分別代表轉(zhuǎn)錄本2、3，條帶較亮，提示高表達(dá)。由于轉(zhuǎn)錄本2引物還能擴增轉(zhuǎn)錄本6，轉(zhuǎn)錄本3的引物還能擴增轉(zhuǎn)錄本2和6（表1），其中轉(zhuǎn)錄本6不表達(dá)，提示條帶3中均是轉(zhuǎn)錄本2，而條帶5中除轉(zhuǎn)錄本3外還含有轉(zhuǎn)錄本2，即在破骨細(xì)胞分化中只有轉(zhuǎn)錄本2、3高表達(dá)。

2.2 CaMKIIδ過表達(dá)載體構(gòu)建 應(yīng)用攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒過表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，可見幾乎全部細(xì)胞都帶有綠色熒光標(biāo)記（圖2），建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

2.3 重組CaMKIIδ在細(xì)胞中的表達(dá) Real?time PCR檢測：過表達(dá)組CaMKIIδ mRNA水平為2.176±0.266，顯著高于對照組的0.955±0.199和空載體組的1.172±0.118（P＜0.05），分別升高了107.8%和85.7%；提示重組CaMKIIδ mRNA在RAW264.7細(xì)胞中得到了有效表達(dá)。

Western?blot檢測見圖3：過表達(dá)組CaMKIIδ蛋白條帶IOD比值為0.958±0.087，顯著高于對照組的0.698±0.017（P＜0.05）和空載體組的0.699±0.077（P＜0.05），分別上升了37.2%和37.1%；而空載體組與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）；提示重組CaMKIIδ蛋白在RAW264.7細(xì)胞中得到了有效表達(dá)。

圖1 破骨細(xì)胞分化第0、1、3、5 d CaMKIIδ各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況Fig.1 Detection of different transcript variants of CaMKIIδ at day 0，1，3，5 during osteoclast differentiation

圖2 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株篩選（熒光倒置顯微鏡，×200）Fig.2 Screening of RAW264.7 cells stably infected by lentivirus（fluorescent inverted microscope，× 200）

2.4 CaMKIIδ過表達(dá)對破骨細(xì)胞分化及功能的影響 TRAP染色顯示三組經(jīng)誘導(dǎo)后均出現(xiàn)TRAP+多核細(xì)胞（圖4）；其中過表達(dá)組破骨細(xì)胞數(shù)目為（22.8±5.1）個，與對照組的（23.8±4.3）個和空載體組的（21.2±2.5）個比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。掃描電鏡（SEM）可見（圖4），三組細(xì)胞在牙本質(zhì)磨片上均有吸收陷窩形成；過表達(dá)組吸收陷窩數(shù)、吸收陷窩面積分別為（2.4±0.9）個和（1 262.720± 477.855）μm2，與對照組［（2.4± 0.5）個和（1 165.200± 572.415）μm2］和空載體組［（2.8±0.8）個和（1 143.760 ± 392.864）μm2］比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果提示，CaMKIIδ過表達(dá)對破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能無顯著影響。

圖3 Western?blot檢測三組細(xì)胞CaMKIIδ蛋白水平Fig.3 Detection of CaMKIIδ protein level among three groups by western?blot

3 討論

破骨細(xì)胞分化或活性增強會引起過度骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、牙周炎和骨腫瘤等疾病的發(fā)生［1?3］；因而破骨細(xì)胞分化調(diào)控研究對上述疾病治療有重要意義。

Ca2+/Calmodulin/NFATc1信號軸對破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要；在該信號軸中，CaMKs是傳遞鈣信號的重要分子。研究發(fā)現(xiàn)，CaMKII和CaMKIV在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮主要作用［4?5，11?13］。CaMKIV 可以通過CREB信號調(diào)控破骨細(xì)胞分化［13］；而PARK?MIN［14］及 WILLIAM 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 刺激可使破骨細(xì)胞分化中CaMKII磷酸化，顯著提高其蛋白活性；但CaMKII發(fā)揮的作用目前還遠(yuǎn)未弄清。

CaMKII有α、β、γ、δ四個異構(gòu)體；國外學(xué)者及我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中表達(dá)最高，且隨時間表達(dá)逐步增強［7?8］，提示其作用可能極為關(guān)鍵。CHANG等［11］研究顯示，CaMKIIδ基因敲除及抑制劑KN93處理，均可使TRAP+破骨細(xì)胞前體百分比顯著下降，并破骨細(xì)胞前體逆轉(zhuǎn)成TRAP陰性細(xì)胞；本團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIIδ RNA干擾不僅抑制多核破骨細(xì)胞生成，而且顯著下調(diào)破骨細(xì)胞分化相關(guān)因子NFATc1、TRAP、非受體酪氨酸激酶（c?Src）的基因表達(dá)［9］；因而推斷CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化信號調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

小鼠CaMKIIδ由于mRNA不同剪切，共有7個轉(zhuǎn)錄本。在破骨細(xì)胞分化調(diào)控中，是否這些轉(zhuǎn)錄本均參與其中呢？為了解決這個問題，本研究通過設(shè)計特異性引物，對破骨細(xì)胞分化過程中CaM?KIIδ 7個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有轉(zhuǎn)錄本2和3高表達(dá)，轉(zhuǎn)錄本1、5、7表達(dá)較弱，而錄本4、6則無表達(dá)。上述結(jié)果提示，CaMKIIδ轉(zhuǎn)錄本2和3可能在破骨細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。上述發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道。

為了進(jìn)一步證實CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中的作用，本研究篩選并構(gòu)建了CaMKIIδ轉(zhuǎn)錄本2的基因重組載體，以探討其過表達(dá)是否會促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組CaMKIIδ在破骨細(xì)胞中得到有效表達(dá)，說明重組載體構(gòu)建是成功的；然而，在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中，過表達(dá)組中破骨細(xì)胞數(shù)目、牙本質(zhì)吸收陷窩數(shù)與吸收陷窩面積與對照組和空載體組并無明顯差異，說明CaMKIIδ過表達(dá)對破骨細(xì)胞生成和功能無明顯影響。

上述結(jié)果似乎與CHANG等［11］及我們前期研究［9］結(jié)論相矛盾；分析原因，這可能與破骨細(xì)胞分化中所需CaMKII信號水平有關(guān)。破骨細(xì)胞分化離不開 CaMKIIδ 的信號刺激［7，9，11］，因而 CaMKIIδ隨著破骨細(xì)胞分化而逐漸表達(dá)增強［7-8］；但細(xì)胞分化所需CaMKIIδ的量可能是一定的，過多的超出生理水平的CaMKIIδ并不能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化；或者破骨細(xì)胞內(nèi)存在負(fù)反饋信號系統(tǒng)，過高水平的CaMKIIδ被其他信號分子的作用所抵消。然而，上述解釋是否正確？哪些負(fù)反饋系統(tǒng)可能參與CaMKIIδ的負(fù)反饋？有待于進(jìn)一步研究證實。