朱新峰

PTMC是指直徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀癌, 其在甲狀腺乳頭狀癌中約在占50%［1］。PTMC高分期、甲狀腺外轉(zhuǎn)移、淋巴管侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)生率近年來明顯升高。PTMC的發(fā)生、發(fā)展與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)［2］。Cripto-1信號通路可能與EMT存在交互關(guān)系, 在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用［3］。E鈣粘蛋白和波形蛋白是EMT的兩個(gè)相關(guān)因子, 在多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)［4］。本研究對甲狀腺良惡性組織中的Cripto-1、E鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析,探討三者在甲狀腺微小乳頭狀癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用, 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年8月～2017年2月在山東濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院外科行手術(shù)治療的患者病理組織標(biāo)本, 其中81例PTMC組織、70例甲狀腺腺瘤組織及65例癌旁甲狀腺正常組織。PTMC腫瘤灶直徑≤1 cm。81例PTMC組織來源患者中男31例, 女 50例；年齡34～65歲, 平均年齡(45.3±7.4)歲；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。70例甲狀腺良性腫瘤均為腺瘤, 其組織來源患者中男22例, 女48例；年齡37～68歲,平均年齡(47.1±8.0)歲。癌旁甲狀腺正常組織來源患者中男20例, 女 45例；年齡36～69歲, 平均年齡 (47.6±8.2)歲。上述實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)及病理檢查證實(shí)。上述患者術(shù)前無放化療及其他方法治療。PTMC在病理檢查過程中并未發(fā)現(xiàn)浸潤。三類組織來源患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 方法 采用ElivisionTMplus法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。具體步驟：①標(biāo)本遵照常規(guī)取材、固定、石蠟包埋, 4 μm厚連續(xù)切片。②石蠟切片脫蠟、水化, 抗原EDTA熱修復(fù), PBS反復(fù)沖洗3 min, 共3次；③3%的H2O2孵育10 min, PBS反復(fù)沖洗3 min, 共3次；④去凈PBS, 加用5% PBS稀釋后的山羊血清封閉孵育10 min, 棄去山羊血清, 滴加一抗4℃過夜,PBS反復(fù)沖洗3 min, 共3次；⑤去凈PBS, 滴加適量含有生物素標(biāo)記二抗的工作液, 37℃孵育10 min；滴加辣根過氧化物酶, 37℃孵育10 min；DAB顯色, 蘇木素對比染色；梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 封片, 鏡下觀察細(xì)胞染色情況。以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察不同甲狀腺組織的Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)情況；分析Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系；分析Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的相關(guān)性。Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)情況通過顯微鏡下可觀察染色情況判定, Cripto-1蛋白定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì), 染色程度≥25%為陽性表達(dá)；E鈣粘蛋白定位于細(xì)胞膜,染色程度≤90%為低表達(dá)；＞90%為表達(dá)保留。波形蛋白定位于細(xì)胞質(zhì), 染色程度≤20%為低表達(dá), ＞20%為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用Fisher精確概率法或χ2檢驗(yàn)；變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織的Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)情況 PTMC組織的Cripto-1蛋白陽性率66.67%、E鈣粘蛋白低表達(dá)率70.37%、波形蛋白高表達(dá)率75.31%均明顯高于甲狀腺腺瘤組織的51.43%、54.29%、47.14%和癌旁甲狀腺正常組織的0、0、0, 甲狀腺腺瘤組織的Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率均明顯高于癌旁甲狀腺正常組織, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤大小的PTMC患者Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTMC患者的Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 不同甲狀腺組織的Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)情況(n, %)

表2 Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系(n, %)

2.3 Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示, Cripto-1高表達(dá)與E鈣粘蛋白低表達(dá)和波形蛋白高表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.31、0.33,P＜0.05)；E鈣粘蛋白低表達(dá)與波形蛋白高表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.34, P＜0.05)。

3 討論

EMT作為機(jī)體的一個(gè)基本病理生理過程, 在胚胎形成、發(fā)育及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。E鈣粘蛋白是上皮細(xì)胞表面的一個(gè)重要生物學(xué)標(biāo)志物, 其表達(dá)缺失與乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤的低分化、高侵襲能力及不良預(yù)后有關(guān)［5］。波形蛋白是EMT重要的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物, 其對間質(zhì)特性的穩(wěn)定起一定作用［6］。Cripto-1蛋白屬表皮生長因子-CFC的家族中的一員, 其參與了早期胚胎發(fā)育與形成、細(xì)胞分化及腫瘤形成和進(jìn)展過程［7-10］。

本研究結(jié)果顯示, PTMC組織的Cripto-1蛋白陽性率66.67%、E鈣粘蛋白低表達(dá)率70.37%、波形蛋白高表達(dá)率75.31%均明顯高于甲狀腺腺瘤組織的51.43%、54.29%、47.14%和癌旁甲狀腺正常組織的0、0、0, 甲狀腺腺瘤組織的Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率均明顯高于癌旁甲狀腺正常組織, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明Cripto-1、E鈣粘蛋白、波形蛋白的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。此外, 本研究顯示, 不同性別、年齡、腫瘤大小的PTMC患者Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTMC患者的Cripto-1蛋白陽性率、E鈣粘蛋白低表達(dá)率、波形蛋白高表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示, Cripto-1高表達(dá)與E鈣粘蛋白低表達(dá)和波形蛋白高表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.31、0.33, P＜0.05)；E鈣粘蛋白低表達(dá)與波形蛋白高表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.34, P＜0.05)說明這三種蛋白相互作用而在PTMC的轉(zhuǎn)移中起著重要作用。

綜上所述, Cripto-1蛋白、E鈣粘蛋白和波形蛋白在PTMC的侵襲轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。深入了解究Cripto-1蛋白及EMT在PTMC發(fā)生、進(jìn)展過程中的作用機(jī)制,對將來PTMC的分子靶向治療及生物學(xué)治療具有促進(jìn)作用。