呂冬霞 張 濤 范曉艷 劉 爽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖(PGF)具有抗腫瘤作用〔1〕。本課題組以往的研究表明，PGF和順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同作用〔2，3〕。本研究旨在觀察PGE聯(lián)合順鉑對(duì)H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 H22肝癌細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院)，昆明種近交系小鼠(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：黑動(dòng)字第99101001)，雄性，體重18～20 g，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。順鉑(齊魯制藥)，PGF(浙江方格藥業(yè))，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基)，倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS)，流氏細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式 處死H22腹水瘤小鼠，取腹水6 ml，離心并用生理鹽水稀釋腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞懸液終濃度為1×107/ml。取雄性小鼠80只，每只小鼠腹腔注射0.5 ml。接種在1 h內(nèi)完成。24 h后，將小鼠隨機(jī)分4組，每組20只。每只每天腹腔注射(0.2 ml)給藥1次，連續(xù)給藥8 d。分組(藥物)如下：PGF組(220 mg/kg PGF)、順鉑組( 2 mg/kg順鉑)、聯(lián)合組(2 mg/kg順鉑+220 mg/kg PGF )、對(duì)照組(生理鹽水)。

1.2.2小鼠日常狀態(tài) 觀察各組小鼠日常表現(xiàn)，如活躍程度、飲食、毛色、腹水等變化。

1.2.3記錄小鼠腹水量 用藥結(jié)束24 h后，每組隨機(jī)取小鼠5只以脫頸法處死，70%酒精消毒，超凈臺(tái)上用無(wú)菌注射器吸取腹水，移入刻度離心管，記錄腹水體積。留存腹水用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.4觀察腹水細(xì)胞形態(tài)變化 取以上每組小鼠腹水制作涂片，觀察H22小鼠腹水細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.5小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取以上各組處死的小鼠腹水5 ml于離心管中，以紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，10 min后離心，棄上清，結(jié)合緩沖液稀釋細(xì)胞，后續(xù)操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6小鼠腹膜滲透性的檢測(cè) 用藥結(jié)束24 h后，每組隨機(jī)取小鼠5只，尾靜脈注射伊文思藍(lán)0.2 ml，2 h后處死小鼠。腹水離心后留取上層腹水，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值(波長(zhǎng)540 nm)。

1.2.7腹水瘤抑制實(shí)驗(yàn) 記錄各組剩余10只小鼠的死亡時(shí)間。統(tǒng)計(jì)各組小鼠平均生存天數(shù)。生命延長(zhǎng)率=〔(T-C)/ C〕×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠生存狀態(tài)比較 約4 d對(duì)照組小鼠出現(xiàn)腹水，約6 d用藥組小鼠出現(xiàn)腹水。對(duì)照組與順鉑組小鼠表現(xiàn)為毛發(fā)疏散易掉、色暗無(wú)光，活動(dòng)遲緩。PGF組和聯(lián)合組小鼠表現(xiàn)為毛亮牢固，活動(dòng)敏銳。

2.2各組腹水量比較 各給藥組腹水量均顯著少于對(duì)照組(均P<0.05)；聯(lián)合組腹水量顯著少于PGF組及順鉑組(P<0.01)。見表1。

2.3各組腹水細(xì)胞形態(tài)變化比較 3組給藥組細(xì)胞體積小，深染而固縮的核，濃縮的染色質(zhì)，呈凋亡形態(tài)。聯(lián)合組凋亡細(xì)胞較PGF組和順鉑組增多。

2.4各組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較 各給藥組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)；聯(lián)合組凋亡率顯著高于PGF組及順鉑組(均P<0.05)。見表1。

2.5各組腹膜滲透性比較 PGF組、順鉑組、聯(lián)合組和對(duì)照組滲透性吸光度值分別為(2.65±0.13)、(3.44±0.27)、(2.54±0.12)和(3.27±0.24)。PGF組、聯(lián)合組與對(duì)照組及順鉑組比較滲透性吸光度值顯著降低(P<0.01)；順鉑組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合組與PGF組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6各組生存期及生命延長(zhǎng)率比較 各給藥組生存期均顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組生存期顯著長(zhǎng)于PGF組及順鉑組；聯(lián)合組生命延長(zhǎng)率顯著高于PGF組及順鉑組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腹水量、凋亡率、生存期及生命延長(zhǎng)率比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01;與聯(lián)合組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

惡性腹水是原發(fā)性肝癌常見并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。目前惡性腹水的治療手段均缺少高級(jí)別的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)〔4〕。尋找新的有效的治療藥物及改善治療策略，提高患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生命期，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較PGF組、順鉑組和聯(lián)合組均能減少H22小鼠腹水量、延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間。本研究結(jié)果表明PGF可降低小鼠腹膜的滲透性，而順鉑對(duì)小鼠的滲透性沒(méi)有影響。本研究結(jié)果提示聯(lián)合用藥對(duì)H22小鼠腹水瘤有更好地抑制作用，其機(jī)制可能是PGF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低小鼠腹膜滲透性，增加順鉑敏感性，從而抑制腹水生成。