王 旭 鄒新中 張彩娣 左志通 陳寶華

(無錫市第三人民醫(yī)院呼吸科，江蘇 無錫 214041)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國高發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，致死率和自殘率均很高〔1〕。目前，肺實質(zhì)和肺血管中的慢性炎癥反應(yīng)和血管重構(gòu)是醫(yī)學(xué)界公認的COPD發(fā)病基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)可引發(fā)支氣管壁損傷-修復(fù)過程反復(fù)進行，誘導(dǎo)血管重構(gòu)，而在此過程中過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)和Toll樣受體(TLR)發(fā)揮重要作用〔2〕。動物實驗顯示，PPAR-α在支氣管哮喘小鼠的血管重構(gòu)過程中發(fā)揮明顯調(diào)控作用〔3〕；TLR4可通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內(nèi)血管重構(gòu)〔4〕，然而PPAR-α及TLR4在COPD患者肺血管重構(gòu)中的作用尚不清楚。本次研究以人體肺組織標本為研究對象，檢測COPD患者與非COPD患者肺組織中PPAR-α及TLR4表達情況，探討其在炎性反應(yīng)和血管重構(gòu)中的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年6月至2015年10月無錫市第三醫(yī)院院行手術(shù)治療的肺鱗癌患者62例。術(shù)中在切除肺葉的同時收集遠離癌組織的正常肺組織為研究標本。根據(jù)術(shù)前患者肺功能指標并依據(jù)COPD診斷標準，將入選患者分為COPD組30例，非COPD組32例。COPD組中男27例，女3例，年齡58～81歲，平均(67.92±7.08)歲；非COPD組中男27例，女5例，年齡57～79歲，平均(67.35±5.41)歲。兩組患者性別、年齡之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 Trizol試劑盒購于上海法默生物科技有限公司；RIPA試劑盒購于上海閃晶分子生物科技有限公司；兔抗人PPAR-α抗體、兔抗人TLR4抗體、鼠源性β-actin單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于上海信裕生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1肺組織形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)中收集的肺組織標本常規(guī)行石蠟包埋，0.3 μm連續(xù)切片，脫蠟至純水中，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片并觀察。肺動脈直徑觀察范圍為150～450 μm，同時評價肺動脈及其周圍炎性細胞浸潤程度。評價標準：0分為無浸潤；1分為存在少量炎性細胞浸潤；2分為炎性細胞浸潤較多，但分布不均勻；3分為炎性細胞浸潤較多且分布均勻，但未出現(xiàn)聚團現(xiàn)象；4分為炎性細胞浸潤分布均勻且聚團。隨機選出6條橫斷面形態(tài)完整的肺小動脈，測量管壁厚度、面積、內(nèi)徑和外徑，計算肺小動脈血管壁橫斷面面積與血管總面積的比值(WA%)，小動脈血管壁厚度與外徑的比值(WT%)。

1.3.2RT-PCR法檢測肺組織PPAR-α和TLR4 mRNA表達 Trizol法提取兩組患者肺組織總RNA用分光光度法測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。引物由上海魯汶生物科技有限公司合成，總反應(yīng)體系20μl，反應(yīng)條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描得到目標條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算PPAR-α、TLR4 mRNA的相對表達量。

1.3.3Western印跡法檢測肺組織PPAR-α和TLR4蛋白表達 RIPA試劑盒提取肺組織總蛋白70 g，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗(1∶500稀釋)，鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃冷藏孵育過夜，滴加HRP標記的二抗，孵育4 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.3.4免疫組化法檢測肺組織PPAR-α和TLR4陽性細胞比例與分布 取兩組患者肺組織石蠟切片，脫蠟、熱修復(fù)抗原，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30min，滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗，4℃冷藏過夜，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示、蘇木精復(fù)染，封片固定，采集圖片并使用Image pro Plus 5.0軟件分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS16.0軟件進行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺組織形態(tài)學(xué)和血管炎癥及重建程度比較 HE染色后顯微鏡下觀察，COPD組肺組織中肺泡形態(tài)和支氣管黏膜不完整，肺小動脈血管壁及周圍存在明顯炎性細胞浸潤；非COPD組肺泡結(jié)構(gòu)和支氣管黏膜完整，小動脈血管壁結(jié)構(gòu)完整，且無明顯增厚，周圍未發(fā)現(xiàn)或極少量炎性細胞浸潤(見圖1)。COPD組炎癥評分明顯高于非COPD組(P<0.01)；COPD組WA%、WT%明顯高于非COPD組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2兩組患者肺組織中PPAR-α及TLR4 mRNA和蛋白表達情況 RT-PCR檢測顯示，COPD組PPAR-α mRNA相對表達量為1.62±0.58，明顯低于非COPD組的3.85±0.74；COPD組TLR4 mRNA相對表達量為2.30±0.35，明顯高于非COPD組的0.91±0.27；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western印跡檢測顯示，COPD組PPAR-α 蛋白相對表達量為14.38±1.96，明顯低于非COPD組的20.65±0.42；COPD組TLR4蛋白相對表達量為25.71±0.39，明顯高于非COPD組的17.24±0.50；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

表1 兩組肺組織血管炎癥及重建程度比較

與非COPD組比較：1)P<0.01

圖1 兩組患者肺組織HE染色(×400)

圖2 Western印跡檢測肺組織中PPAR-α及TLR4蛋白表達

2.3PPAR-α和TLR4陽性細胞表達及分布情況 免疫組化檢測顯示，PPAR-α和TLR4陽性反應(yīng)均為棕黃色顆粒，兩者主要表達于肺血管平滑肌細胞的胞質(zhì)和胞核。COPD組PPAR-α陽性細胞比例為(13.15±4.93)%，明顯低于非COPD組的(31.38±6.04)%(P<0.01)。COPD組TLR4陽性細胞比例為(27.30±6.42)%，明顯高于非COPD組的(15.53±4.05)%(P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組PPAR-α和TLR4免疫組化檢測(×400)

3 討 論

COPD發(fā)病與外部環(huán)境中有害物質(zhì)刺激肺部導(dǎo)致非正常性炎癥反應(yīng)有關(guān)，病理特征以肺部血管和氣道重構(gòu)造為主。本次研究中，COPD患者肺小動脈血管壁厚度和明顯小于非COPD患者，WA%、WT%明顯高于非COPD患者，提示肺部血管重構(gòu)中肺小動脈血管重構(gòu)明顯。相關(guān)研究顯示，COPD患者肺部血管重構(gòu)主要因肺部缺氧導(dǎo)致〔5〕；而最新研究發(fā)現(xiàn)，COPD發(fā)病早期就已出現(xiàn)肺部血管重構(gòu)，在肺部未出現(xiàn)缺氧時已發(fā)生炎癥反應(yīng)〔6〕，提示肺部炎癥反應(yīng)可能是引發(fā)肺部血管重構(gòu)的起始原因。本次研究顯示，存在肺小動脈血管的COPD患者肺部炎性細胞浸潤程度明顯高于非COPD患者，同時炎癥評分明顯增高。

COPD發(fā)病過程中體內(nèi)多種影響炎癥反應(yīng)的細胞因子可發(fā)揮促進或抑制作用。動物實驗顯示，PPAR-α可通過影響AP-1、STAT等因子轉(zhuǎn)錄來抑制支氣管哮喘小鼠的血管重構(gòu)，呈明顯的負相關(guān)〔7〕。以此為基礎(chǔ)，本次研究對PPAR-α在COPD患者肺組織中的作用進行了分析，結(jié)果顯示COPD患者肺組織中PPAR-α mRNA和蛋白表達水平均較非COPD患者明顯降低，PPAR-α陽性細胞比例也明顯低于非COPD患者。提示人肺部PPAR-α表達下調(diào)可降低抗炎作用，促進肺部血管重構(gòu)。TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的免疫分子，能夠經(jīng)病原微生物與細胞壁產(chǎn)物之間的作用激活免疫系統(tǒng)。相關(guān)研究顯示，TLR4可通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內(nèi)血管重構(gòu)〔8〕，但其在COPD患者肺部血管重構(gòu)中的作用仍鮮有報道。本次研究顯示，COPD患者肺組織中TLR4 mRNA和蛋白表達水平均較非COPD患者明顯升高，PPAR-α陽性細胞比例也明顯高于非COPD患者，提示人肺部TLR4表達上調(diào)可促進炎性反應(yīng)，加快肺部血管重構(gòu)。

綜上所述，COPD組患者肺血管均出現(xiàn)不同程度的重構(gòu)，PPAR-α抗血管重構(gòu)的機制與減輕炎癥對血管損傷有關(guān)；TLR4參與血管重構(gòu)的機制與加重炎癥反應(yīng)，促進血管壁細胞外基質(zhì)增加有關(guān)。