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        COPD肺部炎癥反應(yīng)與血管重構(gòu)中PPAR-α及TLR4表達(dá)的關(guān)系

        2018-07-25 05:10:38鄒新中張彩娣左志通陳寶華
        中國老年學(xué)雜志 2018年12期
        關(guān)鍵詞:管壁陽性細(xì)胞炎性

        王 旭 鄒新中 張彩娣 左志通 陳寶華

        (無錫市第三人民醫(yī)院呼吸科,江蘇 無錫 214041)

        慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國高發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病,致死率和自殘率均很高〔1〕。目前,肺實(shí)質(zhì)和肺血管中的慢性炎癥反應(yīng)和血管重構(gòu)是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的COPD發(fā)病基礎(chǔ)。炎癥反應(yīng)可引發(fā)支氣管壁損傷-修復(fù)過程反復(fù)進(jìn)行,誘導(dǎo)血管重構(gòu),而在此過程中過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)和Toll樣受體(TLR)發(fā)揮重要作用〔2〕。動物實(shí)驗(yàn)顯示,PPAR-α在支氣管哮喘小鼠的血管重構(gòu)過程中發(fā)揮明顯調(diào)控作用〔3〕;TLR4可通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內(nèi)血管重構(gòu)〔4〕,然而PPAR-α及TLR4在COPD患者肺血管重構(gòu)中的作用尚不清楚。本次研究以人體肺組織標(biāo)本為研究對象,檢測COPD患者與非COPD患者肺組織中PPAR-α及TLR4表達(dá)情況,探討其在炎性反應(yīng)和血管重構(gòu)中的作用機(jī)制。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 選取2014年6月至2015年10月無錫市第三醫(yī)院院行手術(shù)治療的肺鱗癌患者62例。術(shù)中在切除肺葉的同時收集遠(yuǎn)離癌組織的正常肺組織為研究標(biāo)本。根據(jù)術(shù)前患者肺功能指標(biāo)并依據(jù)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn),將入選患者分為COPD組30例,非COPD組32例。COPD組中男27例,女3例,年齡58~81歲,平均(67.92±7.08)歲;非COPD組中男27例,女5例,年齡57~79歲,平均(67.35±5.41)歲。兩組患者性別、年齡之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

        1.2主要試劑 Trizol試劑盒購于上海法默生物科技有限公司;RIPA試劑盒購于上海閃晶分子生物科技有限公司;兔抗人PPAR-α抗體、兔抗人TLR4抗體、鼠源性β-actin單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購于上海信裕生物科技有限公司。

        1.3研究方法

        1.3.1肺組織形態(tài)學(xué)觀察 術(shù)中收集的肺組織標(biāo)本常規(guī)行石蠟包埋,0.3 μm連續(xù)切片,脫蠟至純水中,蘇木素-伊紅(HE)染色,封片并觀察。肺動脈直徑觀察范圍為150~450 μm,同時評價肺動脈及其周圍炎性細(xì)胞浸潤程度。評價標(biāo)準(zhǔn):0分為無浸潤;1分為存在少量炎性細(xì)胞浸潤;2分為炎性細(xì)胞浸潤較多,但分布不均勻;3分為炎性細(xì)胞浸潤較多且分布均勻,但未出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象;4分為炎性細(xì)胞浸潤分布均勻且聚團(tuán)。隨機(jī)選出6條橫斷面形態(tài)完整的肺小動脈,測量管壁厚度、面積、內(nèi)徑和外徑,計算肺小動脈血管壁橫斷面面積與血管總面積的比值(WA%),小動脈血管壁厚度與外徑的比值(WT%)。

        1.3.2RT-PCR法檢測肺組織PPAR-α和TLR4 mRNA表達(dá) Trizol法提取兩組患者肺組織總RNA用分光光度法測定濃度,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。引物由上海魯汶生物科技有限公司合成,總反應(yīng)體系20μl,反應(yīng)條件:94℃ 10 min,94℃ 5 min,56℃ 50 s,72℃ 1 min,共40個循環(huán),72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,掃描得到目標(biāo)條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參計算PPAR-α、TLR4 mRNA的相對表達(dá)量。

        1.3.3Western印跡法檢測肺組織PPAR-α和TLR4蛋白表達(dá) RIPA試劑盒提取肺組織總蛋白70 g,聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗(1∶500稀釋),鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內(nèi)參,4℃冷藏孵育過夜,滴加HRP標(biāo)記的二抗,孵育4 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,暗室中顯影、采集圖像,分析各條帶灰度值。

        1.3.4免疫組化法檢測肺組織PPAR-α和TLR4陽性細(xì)胞比例與分布 取兩組患者肺組織石蠟切片,脫蠟、熱修復(fù)抗原,H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30min,滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗,4℃冷藏過夜,滴加生物素標(biāo)記的二抗,37℃孵育2 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示、蘇木精復(fù)染,封片固定,采集圖片并使用Image pro Plus 5.0軟件分析。

        1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1肺組織形態(tài)學(xué)和血管炎癥及重建程度比較 HE染色后顯微鏡下觀察,COPD組肺組織中肺泡形態(tài)和支氣管黏膜不完整,肺小動脈血管壁及周圍存在明顯炎性細(xì)胞浸潤;非COPD組肺泡結(jié)構(gòu)和支氣管黏膜完整,小動脈血管壁結(jié)構(gòu)完整,且無明顯增厚,周圍未發(fā)現(xiàn)或極少量炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。COPD組炎癥評分明顯高于非COPD組(P<0.01);COPD組WA%、WT%明顯高于非COPD組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

        2.2兩組患者肺組織中PPAR-α及TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)情況 RT-PCR檢測顯示,COPD組PPAR-α mRNA相對表達(dá)量為1.62±0.58,明顯低于非COPD組的3.85±0.74;COPD組TLR4 mRNA相對表達(dá)量為2.30±0.35,明顯高于非COPD組的0.91±0.27;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western印跡檢測顯示,COPD組PPAR-α 蛋白相對表達(dá)量為14.38±1.96,明顯低于非COPD組的20.65±0.42;COPD組TLR4蛋白相對表達(dá)量為25.71±0.39,明顯高于非COPD組的17.24±0.50;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

        表1 兩組肺組織血管炎癥及重建程度比較

        與非COPD組比較:1)P<0.01

        圖1 兩組患者肺組織HE染色(×400)

        圖2 Western印跡檢測肺組織中PPAR-α及TLR4蛋白表達(dá)

        2.3PPAR-α和TLR4陽性細(xì)胞表達(dá)及分布情況 免疫組化檢測顯示,PPAR-α和TLR4陽性反應(yīng)均為棕黃色顆粒,兩者主要表達(dá)于肺血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核。COPD組PPAR-α陽性細(xì)胞比例為(13.15±4.93)%,明顯低于非COPD組的(31.38±6.04)%(P<0.01)。COPD組TLR4陽性細(xì)胞比例為(27.30±6.42)%,明顯高于非COPD組的(15.53±4.05)%(P<0.01)。見圖3。

        圖3 兩組PPAR-α和TLR4免疫組化檢測(×400)

        3 討 論

        COPD發(fā)病與外部環(huán)境中有害物質(zhì)刺激肺部導(dǎo)致非正常性炎癥反應(yīng)有關(guān),病理特征以肺部血管和氣道重構(gòu)造為主。本次研究中,COPD患者肺小動脈血管壁厚度和明顯小于非COPD患者,WA%、WT%明顯高于非COPD患者,提示肺部血管重構(gòu)中肺小動脈血管重構(gòu)明顯。相關(guān)研究顯示,COPD患者肺部血管重構(gòu)主要因肺部缺氧導(dǎo)致〔5〕;而最新研究發(fā)現(xiàn),COPD發(fā)病早期就已出現(xiàn)肺部血管重構(gòu),在肺部未出現(xiàn)缺氧時已發(fā)生炎癥反應(yīng)〔6〕,提示肺部炎癥反應(yīng)可能是引發(fā)肺部血管重構(gòu)的起始原因。本次研究顯示,存在肺小動脈血管的COPD患者肺部炎性細(xì)胞浸潤程度明顯高于非COPD患者,同時炎癥評分明顯增高。

        COPD發(fā)病過程中體內(nèi)多種影響炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子可發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用。動物實(shí)驗(yàn)顯示,PPAR-α可通過影響AP-1、STAT等因子轉(zhuǎn)錄來抑制支氣管哮喘小鼠的血管重構(gòu),呈明顯的負(fù)相關(guān)〔7〕。以此為基礎(chǔ),本次研究對PPAR-α在COPD患者肺組織中的作用進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示COPD患者肺組織中PPAR-α mRNA和蛋白表達(dá)水平均較非COPD患者明顯降低,PPAR-α陽性細(xì)胞比例也明顯低于非COPD患者。提示人肺部PPAR-α表達(dá)下調(diào)可降低抗炎作用,促進(jìn)肺部血管重構(gòu)。TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的免疫分子,能夠經(jīng)病原微生物與細(xì)胞壁產(chǎn)物之間的作用激活免疫系統(tǒng)。相關(guān)研究顯示,TLR4可通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內(nèi)血管重構(gòu)〔8〕,但其在COPD患者肺部血管重構(gòu)中的作用仍鮮有報道。本次研究顯示,COPD患者肺組織中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較非COPD患者明顯升高,PPAR-α陽性細(xì)胞比例也明顯高于非COPD患者,提示人肺部TLR4表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)炎性反應(yīng),加快肺部血管重構(gòu)。

        綜上所述,COPD組患者肺血管均出現(xiàn)不同程度的重構(gòu),PPAR-α抗血管重構(gòu)的機(jī)制與減輕炎癥對血管損傷有關(guān);TLR4參與血管重構(gòu)的機(jī)制與加重炎癥反應(yīng),促進(jìn)血管壁細(xì)胞外基質(zhì)增加有關(guān)。

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