鄒興斌

(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031)

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤，目前，臨床上對于胃癌治療方法相對較多，包括手術(shù)療法、化療、放療等，分子靶向藥物作為一種新型的治療方法在胃癌治療中也開始運用〔1〕。這些方法雖然能改善患者癥狀，但是5年生存率相對較低，主要與胃癌的轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是一類特殊的細(xì)胞，具有自我更新能力、高效DNA修復(fù)能力及多向分化潛能〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)惡性腫瘤中存在CSCs，該細(xì)胞具備自我分化能力，并且在結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌及胰腺癌中有表達(dá)〔4，5〕。目前，對于GCSCs的制備方法存在較大的爭議，常規(guī)分離鑒定方法以側(cè)群細(xì)胞(SP)法和細(xì)胞表面標(biāo)志物分選法為主，這些方法雖然能分離鑒定GCSCs，但是效果不佳，獲得的細(xì)胞純度相對較低，難以滿足實驗需要〔6，7〕。本研究旨在探討胃癌干細(xì)胞的制備方法及其在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制。

1 對象和方法

1.1材料 人胃癌SGC7901細(xì)胞株：長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校提供；GCSCs細(xì)胞：國家重點實驗室提供。8只裸鼠，體重20～30 g，平均(27±3)g，實驗過程中對裸鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》〔8〕相關(guān)規(guī)則。所有試驗通過長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動物委員會批準(zhǔn)同意，喂養(yǎng)動物房間通風(fēng)良好，晝夜12 h采光，恒溫、恒濕，定期紫外線消毒。

1.2主要儀器和試劑 見表1。

表1 主要儀器和試劑

1.3方法

1.3.1細(xì)胞分離及培養(yǎng) ①細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮灌中取凍存管，置37℃中水浴，快速搖晃確保1～2 min內(nèi)融化，將細(xì)胞凍存液放置在10 cm板培養(yǎng)皿中，加入8 ml培養(yǎng)液，混勻，每天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。②傳代培養(yǎng)：細(xì)胞貼壁融合80.0%以上開始傳代培養(yǎng)，取5 ml培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入胰蛋白酶漫過細(xì)胞，混勻后吸出消化液，37℃溫箱中保溫4 min，待細(xì)胞間隙變大，形態(tài)近似圓形后停止消化。③細(xì)胞凍存：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，利用負(fù)壓吸引器吸取培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，加入胰蛋白酶消化，吹打細(xì)胞。將獲得的懸浮生長細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中800 r/min離心3 min，去除上層清夜，加入凍存培養(yǎng)液，吹打吸管讓細(xì)胞均勻重懸。最后將1.0～1.5 ml細(xì)胞放入凍存管并置于-80℃冰箱中，次日放入液氮罐中保存。④胃癌細(xì)胞培養(yǎng)：取貼壁生長的人胃癌SGC7901細(xì)胞株，放入10.0%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞培養(yǎng)融合90.0%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。⑤胃癌干細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌干細(xì)胞為懸浮生長細(xì)胞，將細(xì)胞放置在超低黏附培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，放入無血清培養(yǎng)基，接種后每天添加適量培養(yǎng)基，7～10 d開始傳代培養(yǎng)及擴(kuò)增〔9，10〕。

1.3.2致瘤性和侵襲性 ①球形克隆實驗：取1×103個人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞，將其接種在超低黏附6孔板中，加入無血清培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，接種后每天觀察瘤球形成情況。②平板克隆實驗，取1×103個人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞，將其接種在超低黏附6孔板中，用含有10.0%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，每天觀察克隆形成情況。③裸鼠成瘤實驗：消化胃癌細(xì)胞吹打制備單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌，以PBS重懸細(xì)胞，采用血球計數(shù)板計數(shù)后PBS稀釋細(xì)胞到50 μl含所需細(xì)胞數(shù)，采用無菌注射器注射到裸鼠腋下，標(biāo)準(zhǔn)無菌條件下飼養(yǎng)，每3～5 d觀察動物狀態(tài)及成瘤情況〔11,12〕。

1.3.3轉(zhuǎn)移能力測定 Transwell遷移試驗測定人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用。讓血清饑餓12～24 h，制備人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞懸液，取24孔板，加入600 μl體積分?jǐn)?shù)20.0%血清，將小室浸入孔中使其濕潤，充分消化細(xì)胞，待消化停止后開始計數(shù)細(xì)胞。按2×105細(xì)胞濃度取200 μl放細(xì)胞溶液到小室中，將24孔板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)兩種細(xì)胞遷移性能不同計算不同時間段透膜細(xì)胞數(shù)，將其放置在甲醛中固定15 min，放入1 ml結(jié)晶紫染色15 min，觀察透膜情況〔13〕。

1.3.4基因芯片法測定ANTXR2水平 將ANTXR2的編碼區(qū)載入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，取對數(shù)生長的人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞，消化后制備續(xù)保懸液，計數(shù)后按照每孔5×104個細(xì)胞接種在24孔板中，過夜培養(yǎng)后將稀釋好的干擾病毒和對照慢病毒分別放入細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后換液一次，去除病毒，擴(kuò)增后利用流式細(xì)胞儀分選感染細(xì)胞中的GFP陽性細(xì)胞，采用實時定量PCR方法檢測2種細(xì)胞下ANTXR2水平表達(dá)情況，利用免疫熒光法檢查ANTXR2及CD44共表達(dá)情況〔14〕。

2 結(jié) 果

2.1胃癌干細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC7901細(xì)胞株培養(yǎng)后開始貼壁生長，培養(yǎng)條件為RPMI-1640(濃度為10.0%FBS)；GCSCs細(xì)胞為懸浮生長，培養(yǎng)條件為無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁生長后呈梭形的間質(zhì)形態(tài)。見圖1。

A為貼壁生長的人胃癌SGC7901細(xì)胞株；B為懸浮生長的GCSCs細(xì)胞；C為貼壁生長的GCSCs細(xì)胞(箭頭表示呈梭形的間質(zhì)形態(tài))圖1 不同培養(yǎng)條件下生長的胃癌細(xì)胞(×100)

2.22種細(xì)胞致瘤性和侵襲性比較 ①球形克隆實驗：將3×103個細(xì)胞接種在6孔板中，加入無血清培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20 d，隨機(jī)取5個視野，計數(shù)每個視野瘤球個數(shù)。結(jié)果顯示：GCSCs細(xì)胞瘤球數(shù)量為(63.92±4.51)個，顯著多于人胃癌SGC7901細(xì)胞株的(6.49±0.70)個(P<0.05)，見圖2。②平板克隆實驗：將1×103個細(xì)胞接種在6孔板中，加入由RPMI-1640組成的3 ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，隨機(jī)取5個視野，計數(shù)每個視野瘤球個數(shù)。結(jié)果顯示：GCSCs細(xì)胞瘤球數(shù)量為(9.61±1.59)個，顯著多于人胃癌SGC7901細(xì)胞株的(1.78±0.82)個(P<0.05)。見圖3。③裸鼠成瘤實驗：成瘤能力是鑒定GCSCs細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示：裸鼠體內(nèi)移植1×104個細(xì)胞球即可發(fā)生腫瘤。GCSCs細(xì)胞移植瘤直徑，顯著大于人胃癌SGC7901細(xì)胞株(P<0.05)。見圖4。

A為人胃癌SGC7901細(xì)胞株形克隆實驗結(jié)果；B為GCSCs細(xì)胞球形克隆實驗結(jié)果圖2 人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞球形克隆實驗(×100)

A為人胃癌SGC7901細(xì)胞株平板克隆實驗結(jié)果；B為GCSCs細(xì)胞平板克隆實驗結(jié)果圖3 人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞平板克隆實驗結(jié)果(×100)

A為GCSCs細(xì)胞成瘤情況(瘤體相對較大，瘤較多)；B為人胃癌SGC7901細(xì)胞株成瘤情況(瘤體單一，體積較小)圖4 人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞成瘤實驗結(jié)果

2.3人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力測定 Transwell遷移試驗結(jié)果顯示，GCSCs細(xì)胞穿過基底膜細(xì)胞數(shù)為(171.92±12.31)個，顯著高于人胃癌SGC7901細(xì)胞株的(85.39±4.91)個(P<0.05)。結(jié)晶紫染色顯示，GCSCs穿過基底膜細(xì)胞數(shù)，多于人胃癌SGC7901細(xì)胞株，提示GCSCs轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。見圖5。

2.4基因芯片法測定ANTXR2水平 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測人胃癌SGC7901細(xì)胞株中ANTXR2陽性細(xì)胞比例占4.98%；GCSCs中ANTXR2陽性細(xì)胞比例占85.48%。通過對ANTXR2陽性的胃癌組織切片，實時定量PCR方法測定顯示：ANTXR2與干細(xì)胞標(biāo)志CD44有共定位現(xiàn)象，提示ANTXR2是GCSCs細(xì)胞中的相關(guān)分子。見圖6。

A為人胃癌SGC7901細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力結(jié)果；B為GCSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力結(jié)果圖5 人胃癌SGC7901細(xì)胞株和GCSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力比較(×100)

圖6 基因芯片法測定ANTXR2水平結(jié)果

3 討 論

隨著人口老齡化日益加劇及生活方式的改變，導(dǎo)致胃癌病發(fā)生率呈現(xiàn)上升及年輕化趨勢。雖然人們對于胃癌的研究已獲得一些新的進(jìn)展，但是對胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全知曉。CSCs最早于1個世紀(jì)前被提出，經(jīng)過后人的努力及研究使得CSCs得到進(jìn)一步充實和補(bǔ)充〔15〕。2006年，美國對CSCs進(jìn)行了定義〔16〕：CSCs是一種特殊的細(xì)胞，具備自我分化能力及多向分化潛能，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由于胃腸道上皮代謝相對較快，導(dǎo)致上皮細(xì)胞突變率較低，但是干細(xì)胞壽命相對較長并且容易產(chǎn)生積累，從而易誘發(fā)癌變。目前，胃癌干細(xì)胞的制備及分離方法相對較多，與其他成體干細(xì)胞類似，胃癌干細(xì)胞主要通過細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行分離和鑒定〔17〕。國外學(xué)者研究〔18〕顯示，在胃癌細(xì)胞中共存在三種腹膜轉(zhuǎn)移高潛力的細(xì)胞，且均可以分離獲得干細(xì)胞標(biāo)志物。本研究中，通過成球培養(yǎng)法能成功分離/富集胃癌干細(xì)胞，同時，實驗結(jié)果還顯示，獲得的胃癌干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性，能富集胃癌干細(xì)胞，提示成球培養(yǎng)法是獲得胃癌干細(xì)胞的一種有效的方法〔19,20〕。

侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌的重要生物學(xué)特征，也是影響療效、術(shù)后復(fù)發(fā)和危及患者生命的獨立危險因素〔21,22〕。本研究表明，GCSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。由于CSCs具備自我更新和高侵襲轉(zhuǎn)移特性，研究中以CSCs為模型，篩選出可能調(diào)控CSCs自我更新及侵襲的分子ANTXR2。ANTXR2又稱為毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生基因2，該基因位于染色體4q21.21上，能結(jié)合到炭疽毒素進(jìn)入細(xì)胞中，屬于炭疽毒素兩個受體之一〔23〕。同時，ANTXR2具有與整合素相類似的性能，可以直接參與細(xì)胞外機(jī)制的調(diào)節(jié)。有報道顯示，ANTXR2基因突變?nèi)菀滓鹦翰Ａ永w維瘤病。同時，ANTXR2能在正常及腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并且在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)能抑制細(xì)胞的增殖和小管形成能力〔24〕。本研究發(fā)現(xiàn)，人胃癌細(xì)胞ANTXR2表達(dá)后容易引起p-Src Tyr416磷酸化降低，從而引起p-Src Tyr527磷酸化位點增高。本研究結(jié)果提示胃癌干細(xì)胞在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中機(jī)制復(fù)雜，ANTXR2在胃癌干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，能進(jìn)一步激活Src/ERK途徑調(diào)控胃癌干細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，可以調(diào)控LRP6經(jīng)過經(jīng)典的Wnt信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔25,26〕。

綜上所述，采用成球培養(yǎng)法能成功分離/富集胃癌干細(xì)胞，具有多向分化、克隆及成瘤能力，同時ANTXR2在胃癌干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，可以作為胃癌預(yù)后指標(biāo)。