黎運(yùn)呈，曾芳，丁賢君，李世波

（1.舟山醫(yī)院 感染科，浙江 舟山 316000；2.舟山市婦幼保健院 產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山316004）

肝癌是成人肝臟最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，也是全世界最常見(jiàn)的惡性程度最高的實(shí)體瘤之一，其病死率位列第三[1-2]。在同一類型的腫瘤中，癌干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）仍然具有異質(zhì)性且可能存在不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的CSCs亞群。有學(xué)者推斷肝癌是肝癌干細(xì)胞（liver cancer stem cells，LCSCs）增殖和分化形成的腫瘤器官，LCSCs的殘存是肝癌復(fù)發(fā)的根源，且至少部分肝轉(zhuǎn)移癌的形成應(yīng)當(dāng)由LCSCs來(lái)完成[3]。有研究者認(rèn)為L(zhǎng)CSCs是肝癌組織侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和源頭[4]。本研究擬在前期研究[5]基礎(chǔ)上，以高遷移肝癌細(xì)胞系（HCCLM3）為研究對(duì)象，建立高侵襲性肝癌干細(xì)胞（high-invasion liver cancer stem cells，H-ILCSCs）和低侵襲性肝癌干細(xì)胞（low-invasion liver cancer stem cells，L-ILCSCs）模型并進(jìn)行生物學(xué)鑒定，為肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究探索新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：NOD-SCID免疫缺陷鼠（6～8周齡）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：20150005）。Mat-rigel膠和流式抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。CD133、CD44、CD90磁珠購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司。B27購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人高遷移肝癌細(xì)胞系HCCLM3、正常肝細(xì)胞HL-7702購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心，其中HL-7702細(xì)胞是第6代。肝癌細(xì)胞HCCLM3培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清；HL-7702培養(yǎng)：RPMI-1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清；H-ILCSCs和L-ILCSCs培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基98%，B27生長(zhǎng)因子2%，再加入EGF/bFGF，使其終濃度為20 ng/mL。所有細(xì)胞均在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分離高、低侵襲性HCCLM3細(xì)胞：參照TIE等[6]的操作方法，首先分離得到高（下室細(xì)胞）/低（上室細(xì)胞）遷移能力的HCCLM3細(xì)胞。將高遷移能力的HCCLM3細(xì)胞懸液加到Transwell小室（涂Matrigel膠）上室，24 h后，取出下室細(xì)胞，獲得高侵襲能力的HCCLM3細(xì)胞；將低遷移能力的HCCLM3細(xì)胞懸液加到Transwell小室（涂Matrigel膠）上室，24 h后，取出上室細(xì)胞，獲得低侵襲能力的HCCLM3細(xì)胞。

1.2.2 免疫磁珠法分選獲得H/L-ILCSCs：采用免疫磁珠分選法以CD133+為分子標(biāo)志分離上述高、低侵襲性HCCLM3細(xì)胞中的干細(xì)胞。參照Miltenyi公司試劑盒說(shuō)明書(shū)，將高、低侵襲能力HCCLM3肝癌細(xì)胞分別懸于500 μL的分選Buffer，制備成1×108/mL的單細(xì)胞懸液，然后在細(xì)胞懸液中加入CD133磁珠微粒100 μL，4 ℃避光孵育30 min，緩沖液沖洗細(xì)胞并離心，棄上清，重懸細(xì)胞進(jìn)行H/L-ILCSCs分選。1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)H/L-ILCSCs表面標(biāo)志分子：參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，以CD133+、 CD90+、 CD44+為L(zhǎng)CSCs表面標(biāo)志，將分選后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞用PBS洗滌2次后重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入CD133-PE、CD90-PE、CD44-APC等抗體5 μL，對(duì)照組分別加入同型對(duì)照抗體5 μL，混勻后4 ℃避光孵育30 min。加入PBS清洗細(xì)胞3次，多聚甲醛固定混勻，上機(jī)檢測(cè)CD133+、CD90+、CD44+的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.4 H-ILCSCs和L-ILCSCs的鑒定及侵襲特性分析：①CCK-8法檢測(cè)生長(zhǎng)增殖能力：收集H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞單細(xì)胞懸液，分別調(diào)整濃度至5×104/mL。取5塊96孔板接種細(xì)胞，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，每組設(shè)平行復(fù)孔3個(gè)。分別在6、12、24、36、48 h隨機(jī)選取96孔板，10 μL的CCK-8試劑加入各孔，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度值，并取平均值。②Transwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)：取分離得到的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105/mL，吸取250 μL細(xì)胞懸液，加入Transwell小室（涂Matrigel膠），上室加入含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每組細(xì)胞重復(fù)5個(gè)樣本。37 ℃孵育48 h后，用棉簽去除上層小室中未侵襲遷移的細(xì)胞。然后將侵襲至下層的細(xì)胞，先用70%甲醇固定10 min，空氣干燥后，用0.1%結(jié)晶紫染色，并于顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算PET膜下表面的侵襲細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)視野計(jì)數(shù)平均值（%）。③平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702，梯度倍數(shù)稀釋細(xì)胞懸液，取含2 mL培養(yǎng)基的六孔板，每孔接種100個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞吹散均勻后繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次，10 d后終止培養(yǎng)。棄上清后PBS洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min。然后去固定液，加適量GIMSA染液染色20 min，計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。④免疫缺陷裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞，消化吹散制成單細(xì)胞懸液，用不含血清的PBS洗2次后，PBS重懸。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為4組，每組6～8周齡的NOD/SCID裸鼠共3只。按照1:1的比例與Matrigel混合，分別皮下接種1×107/mL上述細(xì)胞，2周后開(kāi)始測(cè)量，隔天觀察1次。記錄皮下移植瘤形成時(shí)間及生長(zhǎng)速度，并測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑和短徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所得數(shù)據(jù)用±s表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞CDl33+、CD90+、CD44+表面分子標(biāo)志的表達(dá) 由表1可知，與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3細(xì)胞表面標(biāo)志分子CDl33+、CD90+、CD44+的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H-ILCSCs和L-ILCSCs中CD133+細(xì)胞表達(dá)比例均在90%以上，說(shuō)明免疫磁珠分選純度很高。此外，CD133+細(xì)胞比例在H-ILCSCs和L-ILCSCs間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而H-ILCSCs和LILCSCs中CD133+細(xì)胞比例均高于HCCLM3細(xì)胞（P＜0.01）。H-ILCSCs表面標(biāo)志CD90+、CD44+的表達(dá)均高于L-ILCSCs和HCCLM3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而L-ILCSCs和HCCLM3細(xì)胞CD90+、CD44+的比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組細(xì)胞表面標(biāo)志CDl33+、CD90+、CD44+的陽(yáng)性表達(dá)率（n=3，±s，%）

表1 各組細(xì)胞表面標(biāo)志CDl33+、CD90+、CD44+的陽(yáng)性表達(dá)率（n=3，±s，%）

與HL-7702比：aP＜0.01；與HCCLM3比：bP＜0.01；與L-ILCSCs比：cP＜0.01

組別 CD133+ CD90+ CD44+H-ILCSCs 94.57±1.96ab 92.16±1.55abc 91.69±0.70abc L-ILCSCs 93.39±0.99ab 12.25±1.10a 10.88±1.64a HCCLM3 16.78±3.06a 10.51±1.44a 9.52±1.65a HL-7702 1.49±0.46 1.51±0.80 1.43±0.52

2.2 各組細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力 CCK-8法檢測(cè)連續(xù)培養(yǎng)6、12、24、36、48 h后的吸光度值，結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力逐漸增高；在相同的時(shí)間點(diǎn)，H-ILCSCs的吸光度值明顯高于LILCSCs、HCCLM3、HL-7702細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HCCLM3的吸光度值明顯高于L-ILCSCs和HL-7702細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而L-ILCSCs和HL-7702細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，L-ILCSCs、HL-7702的增殖能力最弱，而H-ILCSCs的細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖曲線圖

2.3 各組細(xì)胞的侵襲能力 取相同細(xì)胞密度的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCCLM3、HL-7702、H-ILCSCs和L-ILCSCs細(xì)胞平均穿膜數(shù)分別是209±36、44±12、488±6、45±8。H-ILCSCs的穿膜數(shù)是正常HCCLM3細(xì)胞的2倍多，是L-ILCSCs的近10倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HCCLM3的穿膜數(shù)是L-ILCSCs和正常HL-7702細(xì)胞的近5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而L-ILCSCs與HL-7702細(xì)胞的平均穿膜數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，HILCSCs侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)，L-ILCSCs和HL-7702細(xì)胞的侵襲能力最弱，見(jiàn)圖2。

2.4 各組細(xì)胞的克隆形成能力 分選后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞置于相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。H-ILCSCs細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，5～7 d后，可見(jiàn)數(shù)十個(gè)細(xì)胞呈球形聚集生長(zhǎng)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，球體逐漸增大，形態(tài)大小各不相同；到第10天時(shí)形成典型的腫瘤球，且相對(duì)致密。HCCLM3可以形成腫瘤球，但球體明顯較少，且球塊不大。而LILCSCs和HL-7702細(xì)胞未見(jiàn)腫瘤球形成。因此，在相同細(xì)胞密度下，H-ILCSCs的克隆形成能力明顯高于HCCLM3細(xì)胞，而L-ILCSCs和HL-7702細(xì)胞不能形成腫瘤球。見(jiàn)圖3。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702的侵襲轉(zhuǎn)移能力（結(jié)晶紫染色，×200）

2.5 接種各組細(xì)胞的免疫缺陷動(dòng)物成瘤能力 接種相同H-ILCSCs和HCCLM3細(xì)胞數(shù)量的裸鼠，在2周后可觀察到開(kāi)始形成移植瘤，成瘤率為100%，而接種L-ILCSCs、HL-7702細(xì)胞的裸鼠未見(jiàn)明顯的瘤體。以1×107/mL細(xì)胞密度接種，H-ILCSCs和HCCLM3形成的移植瘤體積均隨著時(shí)間增加而逐漸增大，而HILCSCs成瘤潛伏期相對(duì)要短，且生長(zhǎng)速度更快。第1、第3、第5、第7、第9天測(cè)量時(shí)，HCCLM3形成的移植瘤體積均大于HCCLM3細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明H-ILCSCs相比HCCLM3、L-ILCSCs、HL-7702細(xì)胞具有更強(qiáng)的成瘤能力。見(jiàn)圖4和表2。

3 討論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用，是上皮來(lái)源癌細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移特性的過(guò)程。有學(xué)者[7-8]認(rèn)為EMT與CSCs關(guān)系密切，分化成熟的癌細(xì)胞能夠通過(guò)EMT獲得干細(xì)胞特性。近年研究也報(bào)道，EMT與CSCs樣特性獲得存在密切關(guān)聯(lián)，二者通過(guò)TGF-β、Notch、Wnt/β-catenin、FGF、PI3k/Akt、Hedgehog等多種信號(hào)通路及信號(hào)串話調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[9]。因此，本課題組采用Transwell侵襲小室，人工模擬EMT過(guò)程，從肝癌細(xì)胞HCCLM3中分離出高、低侵襲性肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)富集后，以CD133+為表面標(biāo)志進(jìn)行磁珠分選，分別獲得H-ILCSCs和L-ILCSCs細(xì)胞，并檢測(cè)了H/L-ILCSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133+、CD90+、CD44+的表達(dá)情況，最后進(jìn)一步與高遷移性肝癌細(xì)胞HCCLM3和正常肝細(xì)胞HL-7702相比較，鑒定其生長(zhǎng)增殖、體外侵襲、平板克隆形成和體內(nèi)裸鼠成瘤能力等生物學(xué)特性。

圖3 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702在無(wú)血清培養(yǎng)基中腫瘤球的形成情況（GIMSA染色，×200）

圖4 接種H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702細(xì)胞的免疫缺陷動(dòng)物的成瘤能力（移植1×107/mL細(xì)胞，成瘤后第9天觀察）

表2 接種H-ILCSCs和HCCLM3細(xì)胞的免疫缺陷動(dòng)物移植瘤體積比較（n=3，±s，mm3）

表2 接種H-ILCSCs和HCCLM3細(xì)胞的免疫缺陷動(dòng)物移植瘤體積比較（n=3，±s，mm3）

與HCCLM3比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天HCCLM3 102.18±40.40 174.54±92.45 215.88±123.45 366.73±163.63 585.60±69.62 H-ILCSCs 316.43±28.91a 507.40±27.95a 785.37±107.86a 1 086.16±106.02a 1 445.69±39.99b

分選后H-ILCSCs和L-ILCSCs細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD133+細(xì)胞比例分別為94.57%±1.96%和93.39%±0.99%，說(shuō)明磁珠分選純度很高。H-ILCSCs細(xì)胞表面標(biāo)志CD90+、CD44+細(xì)胞比例分別為92.16%±1.55%和91.69%±0.70%，與HCCLM3和HL-7702細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明CD133+、CD90+、CD44+可以作為H-ILCSCs的分選標(biāo)志物，這與BAHNASSY等[10]觀點(diǎn)一致。此外，L-ILCSCs細(xì)胞CD133+細(xì)胞比例和H-ILCSCs組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其CD90+、CD44+細(xì)胞的比例明顯低于H-ILCSCs細(xì)胞，與HCCLM3細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明L-ILCSCs表達(dá)低水平的干性相關(guān)分子CD90+和CD44+，LCSCs表面分子標(biāo)志的表達(dá)可能具有異質(zhì)性。這與WRIGHT等[11]的觀點(diǎn)相同，他們?cè)趯?duì)Brcal基因缺陷乳腺癌小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于該類乳腺癌的細(xì)胞中含有2種不同表型的CD44+/CD24-和CD133+亞群細(xì)胞，都具有CSCs樣特征，且這2種表型的細(xì)胞沒(méi)有重疊，推測(cè)CSCs具有異質(zhì)性。

在增殖實(shí)驗(yàn)中，H-ILCSCs的吸光度值在作用相同時(shí)間時(shí)均較L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702細(xì)胞明顯增高，體現(xiàn)了最強(qiáng)的體外增殖能力，而L-ILCSCs生長(zhǎng)增殖能力明顯低于HCCLM3細(xì)胞，與HL-7702細(xì)胞增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見(jiàn)即使是同一種腫瘤內(nèi)，CSCs可能存在不同增殖能力的亞群干細(xì)胞；在Transwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)中，H-ILCSCs侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)，遠(yuǎn)高于L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702細(xì)胞，而L-ILCSCs侵襲能力明顯低于HCCLM3細(xì)胞，與HL-7702細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可見(jiàn)，LCSCs中可能存在不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的CSCs亞群。這與BRABLETZ等[12]、HERMANN等[13]和VISVADER等[14]的觀點(diǎn)類似，他們提出了靜止性CSCs和轉(zhuǎn)移性CSCs的概念，認(rèn)為CSCs具有異質(zhì)性，腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主力“種子”是具有高侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的CSCs導(dǎo)致的，腫瘤轉(zhuǎn)移是具有轉(zhuǎn)移能力的CSCs內(nèi)在特性的表現(xiàn)，它決定了惡性腫瘤的演進(jìn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而靜止性CSCs負(fù)責(zé)維持原發(fā)瘤的生長(zhǎng)，不具有遷移和侵襲能力。本研究平板克隆形成和免疫缺陷動(dòng)物成瘤能力實(shí)驗(yàn)中，HILCSCs和HCCLM3細(xì)胞形成的移植瘤體積均隨著時(shí)間的增加而逐漸增大，且H-ILCSCs裸鼠成瘤潛伏期相對(duì)較短，生長(zhǎng)速度更快，形成的克隆球和移植瘤體積明顯大于HCCLM3細(xì)胞，而L-ILCSCs未見(jiàn)體外克隆球和體內(nèi)裸鼠成瘤形成，這進(jìn)一步說(shuō)明LCSCs具有異質(zhì)性且可能存在不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的CSCs亞群，其中H-ILCSCs是專門(mén)負(fù)責(zé)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的一部分CSCs，而L-ILCSCs成為非侵襲轉(zhuǎn)移性CSCs。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HCCLM3細(xì)胞中可以分離和富集不同侵襲能力的CSCs亞群（H-ILCSCs和L-ILCSCs），且H-ILCSCs的干性特征高于L-ILCSCs，而L-ILCSCs干性特征低于HCCLM3細(xì)胞。因此，本研究認(rèn)為L(zhǎng)CSCs具有異質(zhì)性，可建立更為可信的HILCSCs和L-ILCSCs模型，且二種LCSCs間存在著生物學(xué)特性的差異。在肝癌防治研究或藥物篩選中，可通過(guò)靶向定位于H-ILCSCs，并力求將H-ILCSCs全部清除。