趙慎之，黃賢蘋，項慧秋，廖婷婷，陳佳佳，許張曄

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江溫州 325027）

妊娠是一個炎癥反應(yīng)過程，適度的炎癥反應(yīng)是維持正常妊娠的重要條件之一，而過度激活的炎癥反應(yīng)與多種病理妊娠相關(guān)，如流產(chǎn)、早產(chǎn)、子癇前期等[1-2]。脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）已被證實為體內(nèi)最重要的促炎癥消退介質(zhì)，對多種炎癥細(xì)胞和炎癥相關(guān)因子有著顯著的負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)[3]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)LXA4能激活絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（TEV-1細(xì)胞）核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）mRNA和蛋白的表達[4]，抑制妊娠局部肥大細(xì)胞遷移而保持妊娠炎性微環(huán)境的動態(tài)平衡[5]，說明LXA4在妊娠過程中起著重要作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)LXA4的甲酸基肽受體2（formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2）能在胎盤組織中表達[6]。干擾TEV-1細(xì)胞增殖、遷移和浸潤的因素都可能導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生，本研究探討FPR2對人滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲過程的影響，以期找到FPR2參與病理妊娠的病因及發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1 材料 TEV-1細(xì)胞株由香港大學(xué)Tsao S.W教授惠贈。胎牛血清和DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑Trizol購自上海普飛公司；酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；蛋白抽提、定量、凝膠配制試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；MTS試劑盒購自美國Promega公司，GIEMSA染色液購自美國Sigma公司；FPR2、ILK和GAPDH抗體購自美國CST公司。PCR反應(yīng)引物、FPR2的基因過表達序列均由上海吉凱有限公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 TEV-1細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%熱滅活的FBS、25 mmol/L 4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、100 U/mL青霉素G和100 U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯聚率達到80%～90%時用胰酶消化傳代。

1.2.2 FPR2質(zhì)粒構(gòu)建：獲取人FPR2基因，PCR擴增FPR2基因，連接PCR產(chǎn)物至GV358載體中并送交基因測序。將FPR2片段亞克隆至真核表達載體上并進行鑒定。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和分組：轉(zhuǎn)染前24 h，細(xì)胞以（3～5）×105個/孔接種于24孔板，待細(xì)胞匯集度達約80%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將孔板中培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4 h后換成含胎牛血清的正常培養(yǎng)基。FPR2過表達組（OE組）采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（NC組）采用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.4 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達觀察：于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h，在熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達。

1.2.5 RT-PCR：按照Trizol試劑說明書，提取總RNA后，依照Tiangen試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄操作，制備相應(yīng)cDNA。按照Takara說明書操作實時定量RT-PCR擴增引物序列為：GAPDH上游引物5’-TGACTTC AACAGCGACACCCA-3’，下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAG CCAAA-3’；FPR2上游引物5’-AGTCTGCTGGCTACACTGT TC-3’，下游引物5’-TGGTAATGTGGCCGTGAAAGA-3’；NF-κB上游引物5’-AGGATTTCGTTTCCGTTATGT-3’，下游引物5’-CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC-3’；基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）上游引物5’-GCACCACCACAACATCAC-3’，下游引物5’-ACCACA ACTCGTCATCGTC-3’。反應(yīng)條件為95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環(huán)，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖進行凝膠電泳，凝膠成像后進行定量分析。

1.2.6 Western blot：常規(guī)消化收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，50 mg總蛋白上樣，濃縮膠80 mA、20 min，分離膠120 mA、1 h，電泳結(jié)束后，取出凝膠，300 mA恒流電轉(zhuǎn)約150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，轉(zhuǎn)移膜用5%脫脂奶粉室溫封閉l h后，分別加入一抗（抗FPR2 1:200，抗NF-κB 1:500，抗MMP9 1:1 000和抗GAPDH 1:1 000），4 ℃反應(yīng)過夜，TBST漂洗4次，每次8 min，加入二抗，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，并用TBST洗膜4次，每次8 min，最后電化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.7 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：用30 μg Matrigel膠預(yù)處理Transwell小室，在上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600 μL 30% FBS培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出上室，Giemsa染色液到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞3～5 min后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，空氣晾干，顯微鏡拍照計數(shù)穿過濾過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實驗：單層TEV-1細(xì)胞培養(yǎng)過夜并用吸管尖端引入劃痕。然后用光學(xué)顯微鏡拍攝0、24 h的圖像。細(xì)胞遷移率用細(xì)胞遷移至初始無細(xì)胞區(qū)的百分比計算。

1.2.9 MTT法檢測細(xì)胞活力：收集各組細(xì)胞，于96孔板接種，邊緣孔用無菌PBS填充，每組設(shè)5個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72、96、120 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h，每孔沿孔壁加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值。每個實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染72 h后，用熒光顯微鏡進行可視化分析，結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可見綠色熒光，超過80%的細(xì)胞表達GFP，表明感染成功（見圖1）。

圖1 熒光顯微鏡下觀察TEV-1細(xì)胞（×100）

2.2 FPR2基因過表達后FPR2 mRNA和蛋白表達 FPR2基因過表達后，RT-PCR檢測TEV-1的FPR2基因表達水平，結(jié)果顯示OE組TEV-1細(xì)胞FPR2 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2A；Western blot分析顯示，F(xiàn)PR2基因過表達也顯著增加FPR2蛋白的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2B。

圖2 FPR2基因過表達對TEV-1細(xì)胞中FPR2 mRNA和蛋白表達的影響

2.3 FPR2基因過表達抑制TEV-1細(xì)胞增殖 采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后72 h和96 h，OE組與NC組相比，TEV-1細(xì)胞的增殖能力下降（P＜0.01），見圖3。

2.4 FPR2基因過表達抑制TEV-1細(xì)胞侵襲和遷移Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示OE組細(xì)胞的侵襲能力與NC組細(xì)胞相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A-B。為了進一步確定FPR2對細(xì)胞遷移能力的影響，用劃痕實驗檢測FPR2增強TEV-1細(xì)胞的遷移能力。NC組細(xì)胞自發(fā)遷移，在8 h占據(jù)劃痕區(qū)域的32%，24 h占據(jù)100%劃痕區(qū)域。與NC組相比，OE組在8 h內(nèi)，F(xiàn)PR2細(xì)胞的遷移能力顯著下降（P＜0.01），占據(jù)劃痕區(qū)域的18%，24 h后，劃痕區(qū)域遷移入滋養(yǎng)細(xì)胞，見圖4C-D。

圖3 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力

2.5 FPR2通過NF-κB/MMP9信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞增殖侵襲功能 RT-PCR檢測TEV-1細(xì)胞的NF-κB、MMP9的基因表達水平，結(jié)果顯示OE組TEV-1細(xì)胞NF-κB和MMP9 mRNA水平顯著下降（P＜0.01），見圖5A；Western blot檢測TEV-1細(xì)胞的NF-κB和MMP9蛋白表達水平，結(jié)果顯示OE組TEV-1細(xì)胞NF-κB和MMP9蛋白水平顯著下降（P＜0.01），見圖5B。

3 討論

人類胚胎著床類似于腫瘤的侵人過程，具有一定侵襲性的滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷侵襲母體子宮內(nèi)膜，同時子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)也不斷發(fā)生降解和重建并伴隨有大量血管發(fā)生。滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的適度侵襲，在成功妊娠過程中起重要作用。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足以及過度凋亡是疾病的重要特征[7]。FPR2是G蛋白偶聯(lián)受體，是甲酰肽受體家族的成員。LXA4以及阿司匹林誘導(dǎo)生成的脂氧素也是FPR2的配體，F(xiàn)PR2也稱為FPR2/ALX[8]。FPR2在炎癥過程中可被脂多糖、炎癥因子、前列腺素E2等上調(diào)，發(fā)揮抗炎及促炎癥消退作用[9]。目前認(rèn)為，孕婦的病理生理改變可以用全身炎癥反應(yīng)來解釋，如子癇前期就是嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)[10]，其發(fā)病的根源是胎盤的氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。妊娠早期婦女血清中LXA4及子宮蛻膜中FPR2 mRNA表達明顯高于未孕婦女，說明妊娠早期存在母胎之間的炎癥反應(yīng)交聯(lián)[12]。子癇前期患者胎盤中FPR2的表達明顯高于血壓正常者，并與血清中LXA4的水平呈正相關(guān)，推測子癇前期患者血清內(nèi)LXA4的水平升高可能來源于胎盤中其受體的高表達[13]。FPR2與病理妊娠相關(guān)，任何干擾人類絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移和浸潤的因素都可能導(dǎo)致病理妊娠的發(fā)生。本研究以TEV-1細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)FPR2對TEV-1細(xì)胞的增殖能力有一定影響。過表達FPR2顯著抑制TEV-1細(xì)胞的增殖能力，明顯降低TEV-1細(xì)胞侵襲和遷移能力。這些結(jié)果表明，過表達FPR2可以干擾人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，推測FPR2參與滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控，與流產(chǎn)、胎兒生長受限或子癇前期等病理妊娠的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

圖4 FPR2基因過表達抑制TEV-1細(xì)胞侵襲和遷移

圖5 FPR2通過NF-κB/MMP9信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞增殖侵襲功能

NF-κB是存在于細(xì)胞的快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，其作用為調(diào)控大量基因的轉(zhuǎn)錄，與其調(diào)控的細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生物進程。MMP9降解W型膠原（子宮基底膜的主要成分）而在妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜過程中起到關(guān)鍵作用。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力主要依賴MMP9，只有通過蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)的不同組分，滋養(yǎng)細(xì)胞才具有侵襲和遷移能力。MMP9對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力起著至關(guān)重要的作用。研究證實MMP9是NF-κB靶基之一，過度激活的NF-κB使得MMP9過度表達，降解細(xì)胞外基質(zhì)。對NF-κB/MMP9信號通路的研究集中在腫瘤領(lǐng)域，激活的NF-κB信號通路及其下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶（促進細(xì)胞轉(zhuǎn)移）等參與子宮內(nèi)膜癌惡性發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管生成[14]。有研究報道NF-κB在胚胎種植和胎盤發(fā)育過程中會激活[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達FPR2基因之后，F(xiàn)PR2可以顯著抑制NF-κB/MMP9信號通路的表達，NF-κB、MMP9的蛋白和mRNA水平都明顯下降。過表達FPR2通過抑制NF-κB/MMP9信號通路的表達，最終抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移的能力。我們以往研究證實基因沉默整合素連接激酶通過下調(diào)MMP-9的表達抑制人滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]，F(xiàn)PR2與整合素連接激酶之間是否存在關(guān)聯(lián)，值得進一步研究。

總之，我們的研究表明，過表達FPR2干擾人類絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；過表達FPR2通過抑制NF-κB/MMP9信號通路的表達，最終抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移的能力。這些發(fā)現(xiàn)可能為胎盤相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供參考，為相關(guān)病理妊娠的預(yù)測及治療提供新的依據(jù)。