董 基 張 帥 許開聰 梁志成

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

芡實(shí)，又名雞頭米，為睡蓮科植物芡的成熟種子。芡實(shí)有收斂、滋養(yǎng)、強(qiáng)壯之功效，還具有抗氧化和修復(fù)心肌局部缺血等作用。芡實(shí)殼是芡實(shí)種仁加工過(guò)程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，約占種仁質(zhì)量的40%。芡實(shí)殼主要被農(nóng)民作為薪柴或者丟棄，既造成了資源的巨大浪費(fèi)，又會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)芡實(shí)的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分分析、黃酮類物質(zhì)和淀粉及蛋白的提取等方面，對(duì)芡實(shí)殼多糖提取方面的研究卻少有報(bào)道。芡實(shí)殼多糖的利用價(jià)值還需進(jìn)一步開發(fā)利用，如作芡實(shí)殼多糖抑菌方面的研究等。本試驗(yàn)采用酶法提取芡實(shí)殼多糖，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝。本研究不僅為芡實(shí)殼多糖的提取提供數(shù)據(jù)參考和工藝示范，而且為芡實(shí)殼多糖的應(yīng)用和開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

芡實(shí)殼，由本地農(nóng)戶提供，去掉表面雜質(zhì)。

纖維素酶，活力10 000U/g和氏璧生物科技有限公司；鹽酸、碳酸鈉、石油醚、丙酮、濃硫酸、乙醇、苯酚等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；數(shù)顯電熱恒溫干燥箱，上海圣欣儀器有限公司；D Y F-250A高速粉碎機(jī)，上海比朗儀器有限公司；pHS-25（數(shù)顯）pH計(jì)，上?？茖W(xué)儀器有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

芡實(shí)殼→篩選→清洗→烘干→粉碎→干燥至恒重→樣品→索氏提取法去除脂肪→去離子水浸泡→調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0→纖維素酶水解→水浴浸提→抽濾→多糖濾液→乙醇沉淀→靜置后抽濾→洗滌沉淀物→干燥→芡實(shí)殼多糖

1.3.2 芡實(shí)殼多糖提取

1.3.2.1 樣品處理

取一定量的芡實(shí)殼，除雜后用水清洗，65℃條件下烘干。將烘干后的芡實(shí)殼粉碎，過(guò)40目篩，將過(guò)篩的粉末置于烘箱中于65℃下干燥至恒重。

1.3.2.2 脫脂

稱取適量芡實(shí)殼粉末樣品放入濾包中，以石油醚（60℃～90℃）作為溶劑，用索氏提取法除去芡實(shí)殼粉末中的油脂，將處理好的芡實(shí)殼粉末樣品放在陰涼干燥的容器中備用。

1.3.2.3 調(diào)節(jié)溶液pH值

稱取適量已去除脂肪的芡實(shí)殼粉末樣品置于燒杯中，加入一定量去離子水進(jìn)行攪拌；用膠頭滴管向溶液中加入濃度為0.2mol/L的醋酸鈉緩沖液，定容至50mL，并使用pH計(jì)，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.0。

1.3.2.4 纖維素酶水解

加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的纖維素酶于溶液中，55℃恒溫水浴中靜置3 h；酶解完成后，加熱至沸騰，并保持2min滅酶；抽濾取濾液，用分光光度計(jì)測(cè)定濾液中多糖的吸光度。

1.3.2.5 多糖聚沉

在酶解的濾液中加入3倍體積95%的乙醇溶液，在室溫下靜置12 h。芡實(shí)殼多糖會(huì)以土黃色絮狀物沉淀析出。

1.3.2.6 干燥

用抽濾法，將樣品過(guò)濾出來(lái)，取濾渣，分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，洗滌后，收集濾渣靜置于通風(fēng)櫥通風(fēng)1 h至有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，然后將樣品于60℃下恒溫干燥2 h，將濾紙上的物質(zhì)輕刮取出，即得芡實(shí)殼多糖。

1.3.3 芡實(shí)殼多糖測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定芡實(shí)殼多糖的含量。

1.3.3.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

用葡萄糖作標(biāo)樣（1 mg/mL），依次準(zhǔn)確吸取0 mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于9支25mL的具塞刻度試管，加去離子水至10mL刻度，各加入5%苯酚1.0mL輕輕搖勻后，緩慢加入濃硫酸5mL，再充分搖勻，靜置30min完全冷卻至室溫，將0號(hào)具塞試管作為空白對(duì)照，用可見分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度，橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)葡萄糖質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)多糖溶液吸光度，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.75x-0.033 2，R2=0.994 4，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度的線性范圍為0.107mg/mL ～0.865mg/mL。

1.3.3.2 芡實(shí)殼中的多糖含量

取粗多糖0.1 g，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加水至刻度，配得粗多糖溶液。取粗多糖溶液1mL，測(cè)定其吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出芡實(shí)殼粗多糖的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算多糖提取率：

式中：X——多糖提取率，%；

f——回歸方程中的相關(guān)系數(shù)；

c——芡實(shí)殼多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品濃度稀釋體積，mL；

M——稱取芡實(shí)殼粉末樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.4 芡實(shí)殼多糖提取工藝優(yōu)化

首先通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量及溶液pH值對(duì)多糖提取率的影響，然后利用四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化芡實(shí)殼多糖的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過(guò)的芡實(shí)殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的纖維素酶，并定容至50mL，酶解時(shí)間為2 h，溶液pH為4.0，考察酶解溫度為45℃、50℃、55℃、60℃、65℃時(shí)對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響，結(jié)果見下頁(yè)圖1。

從圖1可看出，隨著酶解溫度的升高，芡實(shí)殼多糖的提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，提取率達(dá)最大值，此后多糖提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過(guò)的芡實(shí)殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的纖維素酶，并定容至50mL，酶解溫度為55℃，溶液pH值為4.0，考察酶解時(shí)間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 酶解溫度對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響

圖2 酶解時(shí)間對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響

從圖2可看出，隨著酶解時(shí)間的增加，芡實(shí)殼多糖的提取率呈上升趨勢(shì)，在達(dá)到2.5 h時(shí)，多糖提取率基本穩(wěn)定。繼續(xù)增加酶解時(shí)間，多糖提取率沒(méi)有顯著變化。

2.1.3 加酶量對(duì)多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過(guò)的芡實(shí)殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，并定容至50mL，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間2.5 h，溶液pH值為4.0，考察纖維素酶加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響。

從圖3可看出，隨著加入纖維素酶量的增加，芡實(shí)殼多糖的提取率也逐漸增加。加酶量為2.5%時(shí)，多糖提取率趨于穩(wěn)定，隨著纖維素酶加入量的繼續(xù)增加，酶解的作用效果并不明顯，多糖提取率甚至有降低趨勢(shì)。

圖3 加酶量對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響

2.1.4 溶液pH值對(duì)多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過(guò)的芡實(shí)殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，并定容至50 mL，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為2.5 h，加酶量為2.5%，考察溶液 pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)對(duì)多糖提取率的影響。

圖4 溶液pH值對(duì)芡實(shí)殼多糖提取率的影響

從圖4可看出，多糖的提取率隨著溶液pH值的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)溶液pH值達(dá)到4.0 h，提取率達(dá)到最大值2.41%。當(dāng)溶液的pH值超過(guò)4.0繼續(xù)增加時(shí)，多糖提取率反而降低。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化芡實(shí)殼多糖提取工藝條件。因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

從表2可看出，各因素對(duì)多糖提取率的影響次序?yàn)锳＞C＞B＞D，即酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響最大，溶液pH對(duì)多糖提取率的影響最??；另外，各因素最優(yōu)水平為A2B3C3D1，即酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為3 h，加酶量為3.0%，溶液pH為4.0，在此條件下提取芡實(shí)殼多糖，測(cè)得多糖提取率為2.45%，高于正交試驗(yàn)所有結(jié)果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用酶法提取芡實(shí)殼中的多糖。先用索氏提取法去除芡實(shí)殼中的脂肪，再用纖維素酶水解芡實(shí)殼中的粗纖維，通過(guò)恒溫水浴浸提的方法，使芡實(shí)殼中的粗纖維沉淀，從而使多糖物質(zhì)游離出來(lái)，再采用苯酚-硫酸法進(jìn)行芡實(shí)殼多糖含量的測(cè)定。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到酶法提取芡實(shí)殼多糖的最優(yōu)的工藝條件為：纖維素酶添加量3%，酶解溫度55℃，溶液pH值4.0，酶解時(shí)間3 h，此工藝條件下芡實(shí)殼多糖提取率可達(dá)2.45%。