溫瑞成 蔡靜波 李芮 程志強(qiáng) 張建峰 董浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

長(zhǎng)期以來，對(duì)于植物病害以及生長(zhǎng)狀況不佳的情況，人們往往依賴于施用大量的農(nóng)藥和化肥來解決問題。然而，農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用不僅使有害生物產(chǎn)生抗藥性，而且使得益生生物大量死亡，同樣化肥的不合理、不科學(xué)施用使得化肥被大量浪費(fèi)并污染農(nóng)田生態(tài)環(huán)境[1-2]。因此，研制出更綠色、高效的新型肥料已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)之一[3]。近些年來，緩/控釋肥、有機(jī)肥和生物肥等已成為研究的重點(diǎn)[4]，其中生物肥料功效顯著、綠色環(huán)保的特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占據(jù)了重要地位，產(chǎn)品用途包括促生、生防和降解等多種類型。在我國，微生物肥料的基礎(chǔ)研究還很薄弱，在一定程度上限制了我國微生物肥料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。

平菇(Pleurotusostreatus)為我國栽培和消費(fèi)最大的菌種之一，其栽培過程剩余的廢棄菌糠含有豐富的菌絲體、氨基酸以及次生代謝產(chǎn)物[6]，但這些廢棄的菌糠并未得到及時(shí)地處理，從而造成浪費(fèi)和污染。如何合理地利用廢棄菌糠變得至關(guān)重要[7-8]。已有研究多是將菌糠加工成飼料和用作花土[9-10]。在合適的土壤濕度下菌糠能夠顯著改善土壤環(huán)境中的菌群比例[11]，利用菌糠栽培蔬菜可以促進(jìn)其優(yōu)良性狀[12]。還有研究利用菌糠培養(yǎng)有益菌種來促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收。例如，利用菌糠培養(yǎng)鏈霉菌和巨大芽孢桿菌的發(fā)酵物促進(jìn)小白菜的生物量增加[13]。

木霉屬(Trichoderma)真菌是重要的生物防治劑，同時(shí)也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[14]。其中哈茨木霉(Trichodermaharzianum)較其他木霉在促生方面有顯著效果[15-16]。例如，利用哈茨木霉分生孢子拌施處理下的多種植株均出現(xiàn)不同程度生物量的增加[17]。因木霉制劑多為活菌孢子制劑，受土壤及其各種環(huán)境影響干擾使得田間應(yīng)用效果不穩(wěn)定[18]，故，本研究采用平菇菌糠培養(yǎng)哈茨木霉，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件，通過補(bǔ)充試驗(yàn)研究其對(duì)哈茨木霉產(chǎn)孢的影響，并利用其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物生長(zhǎng)的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

哈茨木霉菌株T-22、平菇菌糠、野生型煙草(Nicotianatobacum)、野生型哥倫比亞擬南芥(Arabidopsisthaliana)均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 菌糠木霉最佳發(fā)酵條件篩選

(1)哈茨木霉菌的培養(yǎng)。挑取哈茨木霉T-22分生孢子于無菌水中制得孢子懸浮液，吸取50 μL于PDA平板上，涂布靜置后于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)5 d。(2)孢子懸浮液的制備。向平板中加入5 mL無菌水，刷取孢子稀釋成107個(gè)·mL-1懸浮液。(3)培養(yǎng)基發(fā)酵條件篩選。選定接種量、初始含水量、初始pH、溫度和培養(yǎng)時(shí)間為主要影響因素，進(jìn)行L16(45)正交設(shè)計(jì)(表1)，篩選出最佳發(fā)酵條件。

表1 L16(45)正交設(shè)計(jì)

1.2.2 菌糠成分測(cè)定

依據(jù)GB/T 6432—1994[19]、GB/T 6434—1994[20]、GB/T 6433—1986[21]、GB/T 6438—1992[22]對(duì)未使用的菌包、廢棄菌糠，以及上述最佳條件處理后的菌糠發(fā)酵物洗滌、過濾、干燥后進(jìn)行成分(粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗灰分)測(cè)定(重復(fù)5次)，并用SEDX-500型能譜儀(日本島津)、美國Nicolet 5PC紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行能譜(EDS)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析。

1.2.3 木霉產(chǎn)孢量的測(cè)定

補(bǔ)充氮源：根據(jù)菌糠成分，設(shè)計(jì)補(bǔ)充氮源來考察對(duì)產(chǎn)孢量的影響。由于銨鹽是木霉最容易利用的氮源[15]，所以在最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上向其補(bǔ)充不同質(zhì)量濃度的硝酸銨，并對(duì)發(fā)酵4、8、12 d后的孢子量進(jìn)行測(cè)定(重復(fù)5次)，研究其對(duì)木霉產(chǎn)孢量的影響。

補(bǔ)充微量元素：某些微量元素對(duì)木霉生長(zhǎng)具有重要影響，其中Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+對(duì)于哈茨木霉本身具有促進(jìn)作用，根據(jù)補(bǔ)充氮源試驗(yàn)方法檢測(cè)Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+對(duì)哈茨木霉孢子萌發(fā)的影響。

1.2.4 擬南芥、煙草發(fā)芽率的測(cè)定

發(fā)酵液的制備：對(duì)最佳培養(yǎng)條件得到的發(fā)酵物用單層紗布過濾，獲得發(fā)酵液，并稀釋成10倍、20倍、50倍、100倍液。

種子的處理：篩選顆粒大小相近且飽滿的擬南芥、煙草種子，用0.1% HgCl2浸泡10 min，蒸餾水沖洗，再分別用不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液和無菌水在無光條件下浸泡24 h，各選出100粒種子(每處理5次重復(fù))置于濕紗布培養(yǎng)皿中，于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)，逐日統(tǒng)計(jì)平均發(fā)芽率。7 d后測(cè)定發(fā)芽種子的苗長(zhǎng)，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt(Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù))；活力指數(shù)VI=GI×S(S為平均苗長(zhǎng))。

1.2.5 擬南芥、煙草生長(zhǎng)狀況的測(cè)定

將過濾發(fā)酵液得到的固型發(fā)酵物與栽培土以1∶10比例混勻用以作為栽培擬南芥與煙草的栽培基質(zhì)，播種已催芽的擬南芥和煙草種子，分期測(cè)量擬南芥、煙草植株株高、莖粗、最大葉面積、葉片數(shù)、地下部分干質(zhì)量和第1片真葉總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(每處理5次重復(fù))，統(tǒng)計(jì)收獲種子的總質(zhì)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并通過SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌糠木霉最佳發(fā)酵條件

由表2可以看出，各因素的影響由大到小依次為E、B、D、A、C，其中培養(yǎng)時(shí)間和料液比對(duì)其影響最大，即培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，且料液比較高的情況下孢子濃度相對(duì)較高，而溫度、接種量和pH對(duì)其影響不明顯，這也間接說明了該菌株對(duì)菌糠的適應(yīng)能力很強(qiáng)。從最大值上看，最佳組合為A3B3C2D3E3，因此最佳發(fā)酵條件為，接種量為1.5×108個(gè)·mL-1，料液比為1.0 g∶1.5 mL，初始pH為6，培養(yǎng)溫度為26 ℃，發(fā)酵時(shí)間12 d。培養(yǎng)過程中，通過玻璃珠恒溫震蕩，保證哈茨木霉與菌糠的充分混合，減少試驗(yàn)誤差。

表2 平菇菌糠木霉最佳發(fā)酵條件的極差分析結(jié)果

2.2 菌糠成分

由表3可見，菌糠中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，在培養(yǎng)木霉的過程中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯減少，說明了氮源對(duì)木霉生長(zhǎng)的重要性。纖維素和灰分在整個(gè)環(huán)節(jié)中均變化顯著，粗脂肪也有一定程度的減少。由圖1可見，Ca、Mg等微量元素在培養(yǎng)木霉階段大量積累，說明哈茨木霉在生長(zhǎng)過程中需攝入一定Ca、Mg等微量元素供其生長(zhǎng)繁殖。由諸多纖維素、半纖維素的特征峰的變化(圖2)可以看出，哈茨木霉對(duì)纖維素、半纖維素的分解能力極強(qiáng)，進(jìn)一步說明其適宜在菌糠環(huán)境中培養(yǎng)。1 422、1 509 cm-1等峰值的變化很有可能說明，在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生一定量的蛋白及其衍生物，這可能對(duì)植物的生長(zhǎng)、生物防治等方面產(chǎn)生影響。

表3 平菇菌糠成分

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

圖1 平菇菌糠成分能譜(EDS)分析結(jié)果

圖2 平菇菌糠成分傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析結(jié)果

2.3 補(bǔ)充氮源對(duì)菌糠木霉產(chǎn)孢量的影響

菌糠成分中氮源的含量較低(表3)，因此通過外源補(bǔ)充氮源易促進(jìn)木霉的發(fā)酵和繁殖。由表4可見，補(bǔ)充一定質(zhì)量濃度的硝酸銨后均可促進(jìn)孢子量的增加，加入3 g·L-1的硝酸銨培養(yǎng)12 d后是孢子量原來的1.7倍。該結(jié)果與FTIR譜圖分析相一致，進(jìn)一步表明純菌糠培養(yǎng)木霉等對(duì)氮元素有所需求的真菌需要補(bǔ)充一定氮源來提高其產(chǎn)量。

表4 硝酸銨質(zhì)量濃度對(duì)菌糠木霉產(chǎn)孢量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 補(bǔ)充微量元素對(duì)菌糠木霉產(chǎn)孢量的影響

菌糠的能譜(EDS)分析(圖1)表明，菌糠中不僅含有大量的碳源，還含有部分微量元素，通過補(bǔ)充部分微量元素，篩選其最佳補(bǔ)充量。由表5可見，適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充微量元素對(duì)木霉孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，其中加入0.500 g·L-1CaCl2、0.800 g·L-1MgSO4、0.015 g·L-1CuSO4、0.025 g·L-1FeSO4對(duì)菌糠中的孢子量萌發(fā)促進(jìn)效果最大，但高質(zhì)量濃度微量元素的添加不僅不能促進(jìn)孢子萌發(fā)，甚至?xí)种奇咦赢a(chǎn)生，所以適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充微量元素對(duì)菌糠木霉的發(fā)酵具有重要意義。

表5 補(bǔ)充微量元素對(duì)菌糠木霉產(chǎn)孢量的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同一微量元素不同添加量下，木霉產(chǎn)孢量數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.5 菌糠木霉發(fā)酵液對(duì)擬南芥、煙草發(fā)芽率的影響

由表6可見，不同稀釋倍數(shù)的木霉發(fā)酵液對(duì)擬南芥和煙草種子的萌發(fā)都具有一定作用，其中擬南芥和煙草分別在20倍和10倍稀釋液處理下效果最佳，當(dāng)發(fā)酵液稀釋倍數(shù)更低時(shí)對(duì)種子的萌發(fā)具有一定的抑制作用。所以利用其發(fā)酵液催芽時(shí)濃度需嚴(yán)格控制。

表6 菌糠木霉發(fā)酵物對(duì)擬南芥、煙草發(fā)芽率的影響

2.6 菌糠木霉固型發(fā)酵物對(duì)擬南芥、煙草生長(zhǎng)的影響

通過在土壤中拌施菌糠木霉固型發(fā)酵物的方法培養(yǎng)擬南芥和煙草，結(jié)果表明，發(fā)酵物對(duì)擬南芥和煙草的根系以及植株生長(zhǎng)有明顯地促進(jìn)作用，說明菌糠木霉發(fā)酵過程產(chǎn)生了一些促進(jìn)植物生長(zhǎng)以及抑制病害的物質(zhì)，木霉自身在土壤和植物表面的生長(zhǎng)也對(duì)植株生長(zhǎng)起到一定促進(jìn)作用(表7、圖3)。

表7 菌糠木霉固型發(fā)酵物對(duì)擬南芥和煙草的促生作用

注：除生長(zhǎng)時(shí)間外，表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3 討論

本研究利用平菇菌糠作為哈茨木霉培養(yǎng)的基質(zhì)，其發(fā)酵產(chǎn)物在促進(jìn)種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)方面成效顯著，表明菌糠能為哈茨木霉的生長(zhǎng)提供豐富的營養(yǎng)，且哈茨木霉在菌糠培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)能夠直接或者間接促進(jìn)植株生物量的增加。通過對(duì)哈茨木霉發(fā)酵條件的優(yōu)化和外源物質(zhì)的補(bǔ)充試驗(yàn)可以看出，木霉在菌糠中生長(zhǎng)要求不高，對(duì)含水量有一定需求，能在一定程度上適應(yīng)溫度、pH變化的影響，通過添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的氮源和一些微量元素促進(jìn)孢子萌發(fā)，而被木霉利用后的菌糠可進(jìn)一步代謝分解成易于植物吸收的小分子如水溶性有機(jī)碳[23]和微量元素，明顯提高了菌糠的利用率。在國外20世紀(jì)80年代初便能夠利用穩(wěn)定的木霉制劑用于實(shí)際生產(chǎn)[24]，而在國內(nèi)起步較晚，現(xiàn)如今的木霉菌劑多為其分生孢子，成本較高、穩(wěn)定性差、品種質(zhì)量參差不齊，導(dǎo)致在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用、推廣困難，因此，規(guī)范市場(chǎng)制度，加強(qiáng)生物肥料的研究至關(guān)重要。

通過對(duì)3種不同時(shí)期的菌糠成分分析，不難看出菌糠本身的營養(yǎng)價(jià)值可觀，將其合理利用可以降低生產(chǎn)成本。經(jīng)發(fā)酵得到的復(fù)合物中纖維素等物質(zhì)含量變化顯著，說明哈茨木霉在發(fā)酵過程中生長(zhǎng)良好，代謝旺盛，且發(fā)酵物中的原基質(zhì)、菌絲、木霉及其代謝產(chǎn)物在種子萌發(fā)、促生，以及生防方面應(yīng)具有一定作用。研究表明，利用菌糠作為肥料，其中的微量元素較一般有機(jī)肥含量更高，其含有的菌絲體對(duì)植株的生物防治起到良好的輔助作用，既可改良土壤肥力，又對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境的修復(fù)起到積極作用[10]。

A．?dāng)M南芥；B.煙草；a.根系；b.整株；c.第1片真葉；d.生長(zhǎng)20 d；e-CK.生長(zhǎng)40 d(對(duì)照)；e.生長(zhǎng)40 d。

哈茨木霉與土壤有益微生物之間的相互照應(yīng)能夠刺激植物生長(zhǎng)[25]。例如直接施加孢子粉增加番茄等蔬菜種子發(fā)芽率和株高等生物量[26]。哈茨木霉通過對(duì)根系土壤病原菌的抑制，從而調(diào)節(jié)土壤微生物群落，以此可達(dá)到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，同時(shí)植物根莖葉上的哈茨木霉亦可刺激植物產(chǎn)生多種防御因子，增強(qiáng)幼苗活力[27]。哈茨木霉本身還對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用，在生物防治上應(yīng)用廣泛[28]。哈茨木霉在菌糠中發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物以其獨(dú)有的綜合優(yōu)勢(shì)較單純的分生孢子菌劑促生更適合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。

木霉之所以能夠?qū)χ参锊煌鞴倨鸬酱偕饔玫臋C(jī)制尚不清楚，國內(nèi)外大量對(duì)木霉促生作用的研究結(jié)果差異甚大，甚至相反，缺乏說服力[29]。所以，菌糠木霉發(fā)酵物作為生物肥料在促生作用、生物防治以及土壤改良方面上的作用機(jī)制仍需進(jìn)行深入研究，為未來綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。