楊秀蓮 胡蝶 宋佳妮 王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

海州常山(Clerodendrumtrichotomum)，馬鞭草科大青屬，落葉灌木或小喬木，葉片大呈心形且具有特殊氣味，又稱臭梧桐[1]；在我國廣泛分布，國外如日本、朝鮮及菲律賓北部也有分布[2]。海州常山形態(tài)為白花、紅萼、藍(lán)果，且花萼形狀奇特，呈五角形，花果期長達(dá)半年，是夏季觀花、秋季觀果賞萼的優(yōu)良樹種[3]。海州常山對不良環(huán)境有很強(qiáng)的耐受和抵抗能力，可用于鹽堿地區(qū)及礦區(qū)等土地條件惡劣地區(qū)的綠化[4]；其枝葉含有可以殺滅紅蜘蛛、棉蚜蟲和地下害蟲的化學(xué)物質(zhì)[5]，種子的含油量也很高，可在制備生物農(nóng)藥、開發(fā)生物柴油等新能源的領(lǐng)域進(jìn)行研究和推廣[6-7]。綜上，海州常山具有很高的研究價值和很好的應(yīng)用開發(fā)前景，可在城市園林綠化中進(jìn)行廣泛推廣[8-11]。

海州常山常生長于山坡、野地等地方，前人對其研究較晚，現(xiàn)今栽培應(yīng)用的還很少。目前針對海州常山的研究大都集中在抗逆性以及莖葉有效化學(xué)成分和藥理作用方面，對繁殖技術(shù)的研究主要集中在扦插和分株繁殖[12]上，組培快繁方面的研究較少，現(xiàn)只見宋婷等[13]、姜麗瓊等[14]和包崢焱[15]用海州常山莖段作為外植體進(jìn)行快繁的研究，未見有外植體經(jīng)歷脫分化、再分化間接形成完整植株的報道。本研究以海州常山嫩葉為外植體，從消毒方法、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件、植物生長調(diào)節(jié)劑配方等方面，對海州常山葉片愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化進(jìn)行探討，以期建立高效的離體再生技術(shù)體系，彌補(bǔ)海州常山完整組培體系的空缺，為種質(zhì)資源的保護(hù)及規(guī)?；a(chǎn)提供參考，也為后續(xù)的細(xì)胞或分子水平的研究提供基本的試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自南京林業(yè)大學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心海州常山鹽城種源1年生扦插苗，選取健康、無病蟲害的新梢嫩葉為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌體系的建立

葉片先用加有洗潔精的水清洗，毛刷輕刷去葉面上的雜質(zhì)后放在流水下沖洗1 h。預(yù)處理后，將葉片放置超凈工作臺，用75%酒精表面滅菌30 s，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%的HgCl2或5%的NaClO溶液分別進(jìn)行1、3、5、7 min的表面滅菌，無菌水沖洗5～6次，最后將嫩葉切成0.5 cm2大小的方塊，接種于添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，同時添加7.0 g·L-1瓊脂和30 g·L-1蔗糖，以下均同。每個處理接種15瓶，每瓶3塊四周具有切口的葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計外植體污染率、死亡率和存活率。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基的篩選

用最佳的消毒方法對葉片消毒后，將其切成0.5 cm2大小的方塊，接種到添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS、1/2 MS、WPM和B5四種不同基本培養(yǎng)基上。每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織形成率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)光暗條件篩選

將葉片接種在添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織形成率、褐化率和愈傷組織生長狀況。

光暗交替培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 000 Lx左右，光照時間14 h·d-1。

暗培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，無光照。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

根據(jù)上述試驗結(jié)果，在最適培養(yǎng)基上進(jìn)行激素(6-BA+NAA)的篩選，其中6-BA的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5 mg·L-1，每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計褐化率和愈傷組織形成率。

1.2.5 愈傷組織増殖植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

將初代培養(yǎng)獲得的色澤透明淺綠、結(jié)構(gòu)較致密的愈傷組織切塊接種于MS培養(yǎng)基中。設(shè)置原誘導(dǎo)愈傷組織效果最好培養(yǎng)基中的激素處理組合為第1種處理，第2種處理將第1種處理中生長素(NAA)的質(zhì)量濃度降低一半，第3種處理將第1種處理中的生長素(NAA)質(zhì)量濃度升高一倍，第4種處理不添加任何生長調(diào)節(jié)劑作為對照(表1)。每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。20 d后統(tǒng)計各處理的愈傷組織的增殖情況。

表1 愈傷組織增殖植物生長調(diào)節(jié)劑配方

1.2.6 愈傷組織分化植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

將愈傷組織切塊接種于MS培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。其中6-BA質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度為0、0.05、0.10 mg·L-1，共6種組合。每個處理接種15瓶，每瓶3塊愈傷組織，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx左右，光照時間14 h·d-1。30 d后統(tǒng)計各處理的愈傷組織的增殖分化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 20010統(tǒng)計匯總后，利用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

試驗主要統(tǒng)計指標(biāo)有：

污染率=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

死亡率=(死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

愈傷組織形成率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

褐化率=(褐化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

增殖率=(愈傷組織體積增大未褐化的數(shù)量/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

分化率=(產(chǎn)生芽點(diǎn)分化出芽苗的愈傷組織數(shù)量/接種的愈傷組織總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌體系的建立

由表2可知，隨著消毒時間的加長，外植體污染率呈現(xiàn)下降的趨勢，而死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢，存活率先上升后下降。用0.1% HgCl2滅菌7 min時，外植體污染率達(dá)到最低，為6.67%，死亡率達(dá)到最高，為57.78%。存活率在消毒5 min時最高，為64.44%，此時，外植體污染率和死亡率分別為22.22%和13.33%。0.1% HgCl2處理下，滅菌5 min后，外植體死亡率顯著降低。5% NaClO滅菌時總體上效果比0.1% HgCl2處理差。滅菌7 min，外植體污染率達(dá)到最低，為15.56%，死亡率達(dá)到最高，為51.11%，存活率在消毒3 min時最高，為42.22%，此時外植體污染率和死亡率分別為42.22%和15.56%。綜合來看，0.1% HgCl2滅菌5 min，存活率最高，污染率和死亡率也相對較低，因此，對于海州常山的嫩葉來說，最佳的表面滅菌方法是，先用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，0.1% HgCl2溶液處理5 min，無菌水沖洗5～6次。

表2 不同消毒方法對葉片表面滅菌效果的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同一滅菌劑不同滅菌時間時，同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，B5和1/2 MS培養(yǎng)基的愈傷組織形成率較低，分別為6.67%和15.56%，與MS和WPM培養(yǎng)基的愈傷組織形成率呈極顯著差異(P<0.01)。MS、WPM培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，同為37.78%，但MS基本培養(yǎng)基測定結(jié)果3次重復(fù)間的偏差值更小，結(jié)果更穩(wěn)定，所以海州常山葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

表3 不同基本培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 光暗條件篩選

光暗交替培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)。外植體培養(yǎng)到15～20 d時，置于無光條件下培養(yǎng)的葉片開始卷曲(圖1A)，25 d開始出現(xiàn)愈傷組織，愈傷組織呈黃綠色或綠色，較疏松(圖1B)，愈傷組織形成率為44.35%，褐化率為53.23%。而置于光照條件下培養(yǎng)的葉片愈傷組織形成率為0，且褐化嚴(yán)重，褐化率高達(dá)84.44%，比暗培養(yǎng)高出31.21%(表4)。所以黑暗條件下培養(yǎng)更有利于海州常山葉片誘導(dǎo)愈傷組織。

A.接種20 d左右葉片開始出現(xiàn)卷曲；B.接種25 d葉片開始脫分化進(jìn)入細(xì)胞分裂期；C.愈傷組織黃綠，體積略有增大，較緊實；D.愈傷組織增殖有結(jié)構(gòu)形狀生成，表面緊實顆粒狀但未分化；E.愈傷組織分化，葉片生長變薄，顏色變深；F.植株長勢良好，葉面紋路清晰，葉緣出現(xiàn)波狀齒；比例尺：0.5 mm。

圖1 海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

由表5可知，6-BA與NAA不同質(zhì)量濃度組合的8個處理中，處理1愈傷組織形成率最高，可達(dá)66.67%，褐化率最低，為28.89%，與其他7個處理差異顯著；其次為處理2和處理5愈傷組織形成率均可達(dá)37.78%，二者與處理4、6、8均無顯著差異；處理7的愈傷組織形成率效果最差，為4.44%，褐化率也是最高，為91.11%。6-BA為0.50 mg·L-1時愈傷組織形成率均較高，分別為66.67%和37.78%，6-BA質(zhì)量濃度升高后，愈傷組織形成率有所降低，說明在海州常山葉片愈傷組織的形成過程中，細(xì)胞分裂素6-BA在質(zhì)量濃度較低時起到促進(jìn)作用。隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，其愈傷組織形成率并非呈現(xiàn)單純的上升或者下降趨勢，在與其搭配的NAA質(zhì)量濃度變化的共同作用下產(chǎn)生曲線的變化，說明對葉片誘導(dǎo)愈傷組織來說，生長素與細(xì)胞分裂素的比值比質(zhì)量濃度更重要。綜合愈傷組織的誘導(dǎo)率和褐化率分析結(jié)果，得出海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)配方為1號處理，即MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1。

表5 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3 愈傷組織的増殖培養(yǎng)

從表6可知，在未添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，海州常山愈傷組織不生長并且發(fā)生褐化，而其他3個添加了激素的處理都出現(xiàn)了不同程度的增殖甚至是分化，這表明了在海州常山愈傷組織增殖過程中，添加外源生長調(diào)節(jié)劑能有效促進(jìn)愈傷組織的增殖(圖1C)。在4種處理中，2號處理的愈傷組織增大最明顯，生長情況最佳，因此，海州常山愈傷組織增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)方案為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。

表6不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響

處理6-BA質(zhì)量濃度/mg·L-1NAA質(zhì)量濃度/mg·L-1愈傷組織平均大小/mm生長情況10.500.1010.86淡黃綠色體積,較致密20.500.0521.76綠色,較致密,有顆粒狀結(jié)構(gòu)30.500.2014.33黃綠色,較疏松4007.80不生長并且褐化

2.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)

從表7可知，將海州常山愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，有的生長調(diào)節(jié)劑處理下愈傷組織量有增加，顏色由淺綠色變黃綠色，表面有顆粒狀的小突起出現(xiàn)，但未出現(xiàn)分化(圖1D)，如處理2：6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，有的生長調(diào)節(jié)劑處理下愈傷組織量有增加并出現(xiàn)分化(圖1E)，如處理6：6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1。從試驗結(jié)果來看，增殖率和分化率最高的都是處理1，增殖率為55.56%，分化率為13.33%，處理1與處理2、3、5、6均達(dá)到差異顯著水平。故海州常山愈傷組織最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1。

表7 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織分化的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異極顯著(P<0.01)；+生長勢差；++生長勢一般；+++生長勢良好。

繼續(xù)對不同質(zhì)量濃度NAA做多重對比(表8)，可以得出，海州常山葉片愈傷組織分化過程中不同質(zhì)量濃度NAA的處理均達(dá)到顯著水平，且低質(zhì)量濃度有利于愈傷組織的增殖和分化。由表6所得出的海州常山愈傷組織的最佳增殖培養(yǎng)基處理MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，在海州常山愈傷組織的分化培養(yǎng)中未能成功誘導(dǎo)分化，說明在該生長調(diào)節(jié)劑處理下增殖的愈傷組織是非胚性愈傷組織，即表7中的2號處理不適合愈傷組織分化培養(yǎng)。6號處理MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1，增殖率較高，達(dá)到42.22%，但分化率較低，僅6.67%，分化后芽苗的生長狀況較好，莖生長明顯，葉開展(圖1F)。由此可推測，6號處理不太適合愈傷組織的增殖分化培養(yǎng)，但可能適合用于后期莖段的初代培養(yǎng)或者不定芽增殖培養(yǎng)。

表8 不同質(zhì)量濃度NAA對增殖率、分化率的多重比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)之一是建立無菌體系，外植體消毒方法的選擇至關(guān)重要[16]。外植體進(jìn)行表面滅菌要選擇合適的滅菌劑及濃度、滅菌時間及操作順序，不同的植物種類、不同的外植體部位對同樣的表面滅菌過程的反應(yīng)有所差異，最終培養(yǎng)效果也會不同。常用的表面滅菌劑有0.1%的HgCl2、1%～10%的NaClO、1%的AgNO3等，無論是哪種表面滅菌劑，濃度太低時間太短，滅菌不徹底，外植體的污染率就得不到控制；濃度過高，時間過長，對植物造成的傷害太大，會導(dǎo)致外植體細(xì)胞的破壞及產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)，進(jìn)而使外植體產(chǎn)生褐化甚至死亡，降低外植體接種在培養(yǎng)基上后續(xù)培養(yǎng)的存活率，只有選用適宜的濃度和滅菌時間才能既消滅細(xì)菌又保持外植體的活性。本試驗中，5% NaClO和0.1% HgCl2滅菌時間太短(如1 min)無法控制污染，時間太長(如7 min)對于葉片有極強(qiáng)的毒害作用，死亡率升高。此外，還發(fā)現(xiàn)0.1% HgCl2溶液比5% NaClO溶液進(jìn)行相同時間滅菌處理時，0.1% HgCl2的效果更好，周宇晴等[17]在試驗中也得出0.1% HgCl2效果優(yōu)于5% NaClO。本試驗最終得出適宜海州常山葉片最佳的消毒方法為75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，再用0.1% HgCl2溶液處理5 min，無菌水沖洗5～6次，葉片的成活率最高，達(dá)到64.44%。

離體培養(yǎng)的成功與否與基本培養(yǎng)基的類型也息息相關(guān)。不同培養(yǎng)基中含有不同濃度的無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等物質(zhì)，造成培養(yǎng)效果不同。各種植物由于基因型不同適用于不同基本培養(yǎng)基，如棱角山礬葉片適用B5培養(yǎng)基[18]，珙桐[19]、懸鈴木[20]在WPM培養(yǎng)基長勢良好，本試驗選擇MS、1/2 MS、WPM和B5對海州常山的葉片進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果得出，含有較高濃度硝酸鹽和NH4+的MS基本培養(yǎng)基為海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

不同光照條件也會影響植物愈傷組織的生長與發(fā)育。本試驗中暗培養(yǎng)時海州常山葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率高，結(jié)構(gòu)較疏松，而光暗交替培養(yǎng)時愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實，不利于分化。這與油桃[21]、毛桃[22]、薔薇[23]、膝柄木[24]和青錢柳[25]的研究結(jié)果相似，都認(rèn)為暗培養(yǎng)有助于愈傷組織誘導(dǎo)。

愈傷組織誘導(dǎo)和分化也是植物組織培養(yǎng)中的兩個關(guān)鍵部分。愈傷組織是在外植體的受創(chuàng)面附近發(fā)生細(xì)胞加速分裂形成的無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群。愈傷組織生長情況的不同會影響后續(xù)的愈傷組織分化及成苗的培養(yǎng)效果，在試驗中，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及配比對愈傷組織誘導(dǎo)和分化會產(chǎn)生明顯的直接影響[26-27]。6-BA和NAA是愈傷組織誘導(dǎo)和分化中常用的兩種激素，陳穎[28]進(jìn)行銀杏葉的愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，NAA與6-BA組合效果最好，本試驗也采用NAA與6-BA進(jìn)行質(zhì)量濃度篩選。試驗結(jié)果顯示，細(xì)胞分裂素6-BA對海州常山愈傷組織形成率有極顯著的影響，且質(zhì)量濃度較低時(0.5 mg·L-1)起到促進(jìn)作用，與Li et al.[29]和陳雪等[30]已報道的結(jié)果相似，較高質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素阻礙愈傷組織的誘導(dǎo)；而低質(zhì)量濃度的生長素NAA(0.01 mg·L-1)有利于海州常山愈傷組織的分化，這與范小峰等[31]研究結(jié)果相似。木本植物進(jìn)行愈傷組織增殖時，發(fā)現(xiàn)采用比愈傷組織誘導(dǎo)階段更低的生長素質(zhì)量濃度有利于愈傷組織的增殖[18,32]，本試驗也證實了這一點(diǎn)，愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1，愈傷組織最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。

本研究以海州常山的嫩葉作為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和分化研究，以期為海州常山種質(zhì)資源的保護(hù)及規(guī)?；a(chǎn)提供參考，也是為海州常山遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)，后續(xù)就如何克服愈傷組織的褐化，提高愈傷組織分化率和不定芽的生根及移栽還可進(jìn)一步試驗研究。