何新苗， 孟 磊， 李 欣， 孫 蓮， 馬曉麗

(1新疆烏魯木齊市第一人民醫(yī)院， 烏魯木齊 830002； 2新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

桑葉，為?？浦参锷?MorusalbaL)的干燥葉，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]，藥理學(xué)研究表明其具有降血糖、降血脂、抗凝血等作用，是一種珍貴的藥食兩用資源[3]。藥桑在植物分類學(xué)上屬于?？坪谏７N(MorusnigraLinn．)，也是我國唯一的黑桑種，其營養(yǎng)價值極為豐富。

藥桑葉中的主要活性成分包括黃酮、生物堿、植物甾醇及多糖等[4-6]，孫蓮等[7]對新疆不同地區(qū)藥桑葉中的多糖進行提取，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)含量存在一定差異。植物多糖是近年來的研究熱點，藥理活性研究也證明桑葉多糖具有顯著的降血糖作用[8]，有文獻報道桑葉多糖對四氧嘧啶致糖尿病大鼠具有治療效果[9],認為其調(diào)節(jié)糖脂代謝可能與其改善氧化應(yīng)激有關(guān)。因此有必要對新疆藥桑葉多糖及其體外試驗進行深入系統(tǒng)的研究,為新疆桑資源在抗氧化功能方面的食品開發(fā)以及其體內(nèi)抗氧化研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料桑葉采自新疆喀什，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為桑科(MorusablaL.)的干燥葉。

1.2儀器與試劑紫外可見分光光度計UV-2550 (日本，島津),紅外光譜儀IR-Prestige21(日本，島津)，電子恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，電子天平(梅特勒)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，酸度計(上海雷磁)。

藥桑粗多糖(實驗室自制)，DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基)(SIGMA-ALORICH)，ABTS(2, 2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二胺鹽)、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷(trisbase)、鄰苯三酚、抗壞血酸(維生素C)、K2S2O8、甲醇等試劑均為分析純(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)，娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)。

1.3藥桑葉多糖的提取及含量測定

1.3.1 粗多糖的提取

1.3.2 多糖含量測定—苯酚硫酸法[10]精密稱取無水葡萄糖置100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，超聲溶解得濃度為1.00 mg/mL的貯備液，于4℃冰箱中保存。分別取上述葡萄糖溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至25 mL的具塞試管中，用蒸餾水補足至2.0 mL，再加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，然后迅速加入5.0 mL的濃硫酸溶液，搖勻，放置30 min后，以零管作空白，立即于490 nm讀數(shù)。以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)(Y)，以葡萄糖的濃度(C)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

粗多糖含量的測定：稱取藥桑葉粗多糖0.01 g，用蒸餾水定容于 100 mL容量瓶，吸取 1.0 mL多糖液，加入純水補足2.0 mL，再加入1.0 mL 6 %苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，充分震搖后冷卻顯色。在 490 nm 紫外分光光度計測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥桑葉中糖的質(zhì)量濃度，計算多糖得率。

多糖的得率公式(%)=C·n·V/W×100%

式中： C一標(biāo)準(zhǔn)曲線多糖的濃度(mg/mL)

n一稀釋倍數(shù)

V一配成溶液體積(mL)

W一藥桑葉質(zhì)量(g)

1.3.3 藥桑葉粗多糖的紅外鑒定 藥桑葉粗多糖的紅外光譜測定在傅里葉紅外光譜儀(IR-Prestige21)的中紅外區(qū)進行，取1.5 mg經(jīng)干燥的多糖樣品，與同樣條件下干燥過的100～200 mg KBr粉末在瑪瑙研缽中輕輕研磨均勻，經(jīng)壓片機壓成薄片，于4 000～600 cm-1紅外波長范圍下測定。

1.4桑葉粗多糖的體外抗氧化活性

1.4.1 二苯代苦味?；?DPPH·)自由基清除率試驗 參考文獻 [11]的方法，分別配制各個不同濃度的樣品溶液以及維生素C(VC) 的樣品溶液，桑葉多糖和VC的濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL；同時配制0.004%的DPPH·甲醇溶液。

精密量取4.0 mL 0.004% DPPH·甲醇溶液至不同的具塞試管中，再分別加入 1.0 mL各濃度的樣品溶液，30 min 室溫避光處理后用紫外可見分光光度計測定,于516 nm 處立刻讀取吸光度Ai。VC作對照。按下列公式計算各樣品對 DPPH·自由基的清除率。

DPPH·自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

式中，A0表示(DPPH+試樣溶劑)均勻混合后的吸光度;Ai表示(DPPH+供試品溶液)均勻反應(yīng)后的吸光度；Aj為樣品與溶劑的空白吸光度。

1.4.2 二銨鹽自由基(ABTS·)清除率試驗 參考文獻[12]方法，采用乙醇稀釋將 ABTS溶液在 30℃、734 nm 波長條件下的吸光度控制為(0.70±0.02)，即為工作液。精密量取 0.5 mL不同濃度的樣品溶液加入試管中，與15.0 mL 的 ABTS工作液混勻，室溫靜置并于暗處反應(yīng) 6 min， 734 nm 處測吸光值為Ai。嚴(yán)格按下列公式計算各樣品對ABTS·自由基的清除率。

ABTS·自由基清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100%

上式中Ai為加入供試品溶液后吸光值； Ab加入蒸餾水時吸光值。

1.4.3 羥自由基(·OH)清除率試驗 參考文獻[13]方法。分別取不同濃度的多糖溶液1.0 mL，依次加入1.0 mL 0.75 mM鄰菲羅啉乙醇溶液，1.0 mL 0.75 mM FeSO4溶液，1.0 mL 0.01% H2O2溶液，2.0 mL PBS緩沖液(pH=7.4)，混勻后在37℃水浴1 h,立刻在512 nm波長處測吸光度值A(chǔ)i，VC作對照。按下列公式計算各供試品溶液對羥自由基的清除率。

·OH自由基清除率(%)=(Ai-A0)/(Aj-A0)×100%

上式中Ai為加入樣品反應(yīng)后溶液的吸光值；相同條件下，1 mL去離子水代替多糖溶液，其他溶液如樣品組，所測吸光度值即為A0；相同條件下，去離子水代替H2O2測定吸光度值記為Aj。

清除率(%)=(△A1/△t-△A2/△t)/(△A1/△t)×100

式中：△A1/△t為鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率；△A2/△t為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1藥桑葉多糖含量以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)(Y),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(C)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=18.95X-0.100 9(X為葡萄糖質(zhì)量濃度，A為吸光度)，R2=0.994 3，線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥桑葉多糖提取率。代入多糖的得率計算公式(%)=C·n·V/W×100%，最終藥桑葉多糖的含量為3.85%,見圖1。

2.2藥桑葉多糖的紅外光譜分析桑葉多糖具有典型的糖特征吸收峰，在3 600～3 200 cm-1區(qū)段中，3 387 cm-1處為-OH伸縮振動，在3 000～2 800 cm-1區(qū)段中，2 927 cm-1為甲基、亞甲基的伸縮振動峰，在2 800～1 200 cm-1區(qū)段中，1 639 cm-1處的峰顯示該多糖中存在酰胺基，在1 410～1 200 cm-1區(qū)段中，1 410 cm-1為C-H的變角振動，在1 200～800 cm-1區(qū)段中，891 cm-1處的吸收峰表明多糖結(jié)構(gòu)中存在β型-吡喃糖苷鍵(圖2)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 桑葉多糖的紅外光譜

2.3藥桑葉多糖清除DPPH·的能力DPPH·自由基是一種氮族自由基，因其易與具有氫鍵供體的化合物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)而被廣泛應(yīng)用于抗氧化研究中，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，清除效果是增強的，不同濃度的樣品對 DPPH 自由基的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系(圖3)。在濃度為1.2 mg/mL時，清除率達21.77%,這表明藥桑葉具有清除 DPPH自由基的能力，清除效果不及VC。鐘耀廣等[15]報道香菇多糖未脫蛋白的粗多糖也具有抗氧化活性，本次試驗也證明藥桑葉粗多糖同樣具有抗氧化活性。

圖3 DPPH·的清除曲線

2.4藥桑葉多糖對ABTS的清除能力ABTS自由基陽離子清除實驗是ABTS自由基陽離子的清除能力評價依據(jù)為不同濃度受試物對ABTS自由基陽離子溶液吸光度的影響，該方法最早由Miller提出[16]，隨時間加工被廣泛用于天然藥物活性測試尤其是抗氧化活性(圖4)。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)桑葉多糖對ABTS自由基具有一定的清除作用，雖較維生素C弱，但清除率亦隨著多糖濃度的增加而上升，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系，在濃度為1.2 mg/mL時，清除率達到25.16%。

圖4 對ABTS的清除曲線

2.5桑葉多糖對羥自由基(·OH)的清除能力羥自由基(OH-)作為生物體細胞內(nèi)反應(yīng)活性最為強烈的氧族自由基，是在超氧陰離子和過氧化氫被金屬離子催化作用產(chǎn)生。待評價物質(zhì)中的抗氧化物質(zhì)可以競爭捕捉體系中的羥自由基，因此，該法也是評價天然植物多糖抗氧化活性的重要組成部分。藥桑葉多糖隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，對羥自由基的清除作用也隨之增強，同時具有較強的清除羥基自由基的能力，清除效果與VC接近(圖5)；在濃度為1.2 mg/mL時，清除率達到91.3%，這說明粗多糖的羥基基團能夠提供氫電子與羥基反應(yīng)是起到清除羥基自由基的作用關(guān)鍵。

圖5 對羥自由基的清除曲線

由圖6可見，藥桑葉多糖對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2) 的清除率一直處于較高水平,與維生素C相近，在質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，清除率可以達到85.94%，說明藥桑葉多糖具有較好的抗氧化活性。

圖6 超氧陰離子自由基清除能力

3 結(jié)論

本試驗采用傳統(tǒng)的水煎法提取藥桑葉粗多糖并測定多糖的得率為3.85%，紅外光譜對粗多糖的鑒定同樣顯示了多糖特征官能團相關(guān)的譜峰，進一步驗證了本次試驗提取得到的多糖樣品。

在體外抗氧化活性檢測方面，試驗采用了四種不同的自由基進行抗氧化能力試驗，比較全面、真實地了解了藥桑葉多糖具有超強抗氧化的功能。試驗結(jié)果表明，桑葉多糖對不同的自由基包括生物體細胞內(nèi)反應(yīng)活性最為強烈的氧族自由基的清除能力是不同的，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系，雖然在DPPH自由基試驗和ABTS自由基試驗中發(fā)現(xiàn)抗氧化活性均遠較 V C弱 ，但在一定濃度范圍下，抗羥自由基和超氧陰離子自由基試驗中展現(xiàn)了良好的抗氧化性能，說明藥桑葉多糖具有抑制自由基生成的作用，可以作為自由基清除型抗氧劑應(yīng)用；另外，由于本次試驗采用粗多糖進行，粗多糖中可能含有各種不同級份的多糖，因此需要進一步試驗將粗多糖進行純化，并說明每一級份多糖的單糖組成，再結(jié)合體內(nèi)體外試驗全面說明其抗氧化作用或者不同級份多糖的抗氧化能力大小，為高效開發(fā)藥桑葉多糖功能食品及藥品提供參考。