黃雙霞，相萍萍，齊鵬翔，藍(lán)尉冰，王帥靜，陳玉穎，陳山，3＊

（1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004；2.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，南寧 530004；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004）

右旋糖酐（Dextran）是一種經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖而產(chǎn)生的葡聚糖，主鏈由α－（1，6）糖苷鍵鏈接，同時(shí)伴有α－（1，2）、α－（1，3）或α－（1，4）糖苷鍵鏈接的側(cè)鏈［1，2］。右旋糖酐的生物活性與其分子量大小及分布緊密相關(guān)，被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕化工等領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景［3］。其中，大分子質(zhì)量的右旋糖酐（Mw＞106Da）可用作色譜柱填充劑；在食品行業(yè)中，中等分子質(zhì)量的右旋糖酐（105Da＜Mw＜106Da）作為飲料和糕點(diǎn)制作中的乳化劑、穩(wěn)定劑、保濕劑和增稠劑，應(yīng)用于復(fù)合調(diào)味品中以提高食品的口感與風(fēng)味［4，5］。此外，在烘焙食品中使用右旋糖酐可增加面包的柔軟度及膨脹度，并改善面包的質(zhì)地；添加到果糖糖漿以及糖果中可以阻止蔗糖結(jié)晶；并且還可以作為部分麥芽糖代替品，制作軟心巧克力的填充物［6］；低分子質(zhì)量的右旋糖酐（104Da＜Mw＜105Da）適合在臨床上用作血漿替代品［7，8］；小分子質(zhì)量的右旋糖酐（Mw＜104Da）還可以用來制備右旋糖酐衍生品，作為益生元組分提高腸道內(nèi)益生菌，如雙歧桿菌、乳酸桿菌［9］。

目前，右旋糖酐的工業(yè)制備方法為傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵法，經(jīng)酸水解及乙醇分級(jí)沉淀后獲得不同分子量的右旋糖酐粗品，然而該法普遍存在操作步驟復(fù)雜、產(chǎn)物得率低及均一度不高等問題［10，11］。此外，發(fā)酵體系中含有大量菌體及其他培養(yǎng)基成分，致使其合成過程的規(guī)律及機(jī)理研究較難進(jìn)行。酶法反應(yīng)體系簡(jiǎn)單且具有專一性，可獲得高含量的目標(biāo)產(chǎn)物，副產(chǎn)物少并易于純化，避免大量有機(jī)試劑的使用，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、香精、香料、表面活性劑及抗生素等物質(zhì)的生物合成與轉(zhuǎn)化［12］。且相對(duì)于菌體發(fā)酵過程，酶法合成體系有利于對(duì)其合成過程的調(diào)控及聚合規(guī)律進(jìn)行研究［13，14］。此外，作為一種糖苷水解酶，右旋糖酐酶可以專一地識(shí)別和隨機(jī)地切割右旋糖酐糖鏈中的α－（1，6）糖苷鍵，因此在單酶體系中引入右旋糖酐酶，可進(jìn)一步探索雙酶法制備低聚右旋糖酐的過程規(guī)律［15］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建單酶體系和雙酶體系，對(duì)酶法催化蔗糖制備不同分子量右旋糖酐的過程規(guī)律進(jìn)行探索和討論，為促進(jìn)不同分子質(zhì)量右旋糖酐在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用菌株：為本實(shí)驗(yàn)室馴化、保藏的腸膜明串珠菌Glu－L.M.［16］；右旋糖酐酶：產(chǎn)于細(xì)麗毛殼菌，分子量59kDa，日本田野酶制劑有限公司。

右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Polymer Laboratories Ltd.；果糖、蔗糖、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸、氯化鈣、3，5－二硝基水楊酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇（PEG）6000（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、酵母膏（生物試劑）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPGFC色譜儀Aglient 1100（配有示差折光檢測(cè)器 Agilent G1362A 及 Agilent GPC 數(shù)據(jù)分析軟件） 美國(guó)Aglient公司；LS－B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；ZHJH－1115C垂直流超凈工作臺(tái)、ZHWY－211B全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；SHP－150生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Avanti J－E高效離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Stat Fax 2100酶標(biāo)儀 美國(guó)Awareness公司；Barnstead Easy Pure LF超純水機(jī) 美瑞泰克科技（天津）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 右旋糖酐蔗糖酶的制備和分離純化

復(fù)活保存在－80℃超低溫冰箱的腸膜明串珠菌，接種于斜面培養(yǎng)基中，25℃，24h恒溫培養(yǎng)；平板劃線接種于基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h；挑取單菌落至種子培養(yǎng)基中，25℃，150r/min搖床培養(yǎng)；對(duì)數(shù)期接種2%（V/V）至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（搖床培養(yǎng)條件同上）；培養(yǎng)20h后將發(fā)酵液取出裝入離心管中，4℃，12000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，上清液即右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。

右旋糖酐蔗糖酶粗酶液采用課題組前期研究的雙水相法進(jìn)行純化［17］。向20mL右旋糖酐蔗糖酶粗酶液中加入50%（W/W）的PEG 6000溶液，然后用無(wú)菌水補(bǔ)足至雙水相體系的終質(zhì)量為40g，充分震蕩混合后放于4℃冰箱，靜置12h后，4℃，12000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，除去雙水相上相中的液體，下相即為純化后的右旋糖酐蔗糖酶酶液。

1.3.2 右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的酶活測(cè)定

右旋糖酐蔗糖酶是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，能催化蔗糖產(chǎn)生等量的D－吡喃葡萄糖基和果糖，D－吡喃葡萄糖基轉(zhuǎn)移到右旋糖酐鏈上，而果糖分子游離于體系中。因此，酶活單位（U）定義為：在25℃催化單底物蔗糖1min內(nèi)生成1μmol果糖所需的右旋糖酐蔗糖酶酶量。通常采用3，5－二硝基水楊酸（DNS法）來測(cè)定果糖含量，根據(jù)吸光度與還原糖含量的線性關(guān)系獲得酶活［18］。

右旋糖酐酶能專一性地水解大分子右旋糖酐中的α（1，6）糖苷鍵，生成小分子還原糖。通過Hens法測(cè)定小分子還原糖含量，以此間接計(jì)算右旋糖酐酶酶活力［19］。25 ℃ 條件下，1min 內(nèi)右旋糖酐酶催化Dextrant－70產(chǎn)生與1μmol硫代硫酸鈉還原力相當(dāng)?shù)倪€原糖所需酶量，定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 單酶體系合成右旋糖酐的建立

實(shí)驗(yàn)以右旋糖酐蔗糖酶和蔗糖溶液接觸時(shí)開始計(jì)時(shí)，以果糖峰開始下降的前一個(gè)取樣點(diǎn)作為聚合反應(yīng)的終點(diǎn)［20］。底物蔗糖溶液（0.1～0.8mol/L），右旋糖酐蔗糖酶（0.1～0.6U/mL），構(gòu)建反應(yīng)體系的終體積為50mL，25℃，150r/min搖床培養(yǎng)，利用 HPGFC跟蹤檢測(cè)底物濃度、右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)右旋糖酐的分子量及其分布、分子量片段所占比例、右旋糖酐產(chǎn)量及蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律。在兩者反應(yīng)18，20，22，24，26，28，30h分別對(duì)各個(gè)系列的樣品進(jìn)行取樣。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)沸水浴滅活后，用超純水稀釋100倍，過0.45μm微孔膜，待測(cè)。

1.3.4 雙酶體系合成右旋糖酐的建立

選取蔗糖濃度0.6mol/L、右旋糖酐蔗糖酶添加量0.4U/mL，在右旋糖酐酶添加量0.06U/mL時(shí)考察不同右旋糖酐酶的加入時(shí)間（0，4，8，12，16h）對(duì)反應(yīng)體系中右旋糖酐的聚合影響規(guī)律；并研究右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶的酶活比（0.08∶1，0.09∶1，0.10∶1，0.11∶1，0.12∶1）對(duì)右旋糖酐的分子量及分子量片段的調(diào)控效果，反應(yīng)2，4，6，8，10，20，30h分別對(duì)各個(gè)系列的樣品進(jìn)行取樣，樣品處理方法見1.3.3。

1.3.5 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)下各標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

色譜柱：KS－guard＋KS－805＋KS－801；色譜條件：安捷倫1100系統(tǒng)配RID示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為超純水，流速1.0mL/min，檢測(cè)器溫度33℃，柱溫箱溫度65℃，進(jìn)樣20μL。將分子質(zhì)量分別為5900，22800，47300，112000，212000，404000，778000Da的右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品，配成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.45μm的微孔膜過濾，進(jìn)樣量20μL，每個(gè)樣品平行操作3次。精確配制蔗糖、葡萄糖和果糖溶液的系列濃度，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)樣，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2值。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPGFC雙柱串聯(lián)檢測(cè)下的各擬合方程

根據(jù)右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)品的HPGFC檢測(cè)結(jié)果，得到下式右旋糖酐分子量校正曲線的擬合方程：

式中：y為右旋糖酐分子量的對(duì)數(shù)，x為洗脫體積（mL），R2值為0.9998。表明 HPGFC雙柱串聯(lián)使用能夠很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物中各個(gè)分子量右旋糖酐的測(cè)定。

蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程見表1。

表1 蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程Table 1Fitting equations of standard curves of sucrose，glucose and fructose

由表1可知，三者的R2值均大于0.99，線性相關(guān)性較好，表明蔗糖、葡萄糖及果糖濃度的定量可以有效地根據(jù)HPGFC雙柱串聯(lián)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)。

2.2 底物濃度及右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)右旋糖酐分子量及分子量分布的影響

不同底物濃度（0.1～0.8mol/L）及右旋糖酐蔗糖酶加入量（0.1～0.6U/mL）對(duì)各反應(yīng)體系中右旋糖酐分子量及其分布、各分子量片段所占百分比例的影響見表2。

表2 不同蔗糖濃度下右旋糖酐分子量及其分布情況Table 2Molecular weight and its distribution of dextran with different sucrose concentration

同一右旋糖酐蔗糖酶添加量，右旋糖酐的分子量隨著蔗糖濃度的增加先增大后減小，且分子量大小均在100萬(wàn)以上；Mw＞106Da分子量片段所占比例較高，均在80%以上；在低蔗糖濃度（0.1～0.4mol/L）時(shí)，酶量不變，隨著蔗糖濃度的升高，體系中有足夠的蔗糖分子與酶分子的活性位點(diǎn)接觸，催化產(chǎn)生的葡萄糖基不斷鏈接到糖鏈上合成大分子量的右旋糖酐；但當(dāng)高蔗糖濃度較高時(shí)（0.6～0.8mol/L），右旋糖酐分子量隨蔗糖濃度的升高而降低，僅有少量Mw＜104Da分子量片段合成。可能的原因是高濃度蔗糖溶液會(huì)改變合成酶活性位點(diǎn)的構(gòu)象［21］，使酶催化蔗糖聚合生成高分子量右旋糖酐的反應(yīng)受到抑制，促進(jìn)受體反應(yīng)合成低聚糖，這與前期研究單酶耦合兩級(jí)膜制備右旋糖酐反應(yīng)過程中底物濃度對(duì)右旋糖酐分子量的影響規(guī)律一致。

同一底物蔗糖濃度（0.1mol/L），右旋糖酐的分子量隨著右旋糖酐蔗糖酶加入量的增大而增大，其中Mw＞106Da高分子量片段所占的比例隨著酶加入量的增加而增加，104Da＜Mw＜105Da和105Da＜Mw＜106Da分子量片段所占比例隨著酶加入量的增加而不斷減少，體系幾乎不產(chǎn)生Mw＜104Da低分子量片段。可能是由于本實(shí)驗(yàn)蔗糖濃度相對(duì)較低，隨著右旋糖酐蔗糖酶量的增加，反應(yīng)體系中酶活性位點(diǎn)增多，使得酶催化蔗糖產(chǎn)生葡萄糖基的速率加快，葡萄糖基不斷被轉(zhuǎn)移到正在增長(zhǎng)的右旋糖酐糖鏈上，使右旋糖酐分子質(zhì)量不斷加大，因此體系主要聚合成高分子質(zhì)量的右旋糖酐［22］。

2.3 底物蔗糖濃度及右旋糖酐蔗糖酶添加量對(duì)右旋糖酐產(chǎn)量及蔗糖轉(zhuǎn)化率的影響

分別研究不同底物濃度下（0.1～0.8mol/L）和不同右旋糖酐蔗糖酶的加入量（0.1～0.6U/mL）對(duì)反應(yīng)體系中蔗糖轉(zhuǎn)化率及右旋糖酐產(chǎn)量的影響規(guī)律，見表3。

表3 不同右旋糖酐蔗糖酶加入量及蔗糖濃度條件下蔗糖轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐得率的變化Table 3Effect of dextransucrase additive amount and sucrose concentration on the conversion rate of sucrose and yield of dextran

在右旋糖酐蔗糖酶加入量不變的情況下，當(dāng)蔗糖濃度從0.1mol/L增大至0.8mol/L時(shí)，蔗糖的轉(zhuǎn)化率隨底物蔗糖濃度的增大整體呈下降趨勢(shì)，而右旋糖酐產(chǎn)量隨底物蔗糖濃度的增大而逐漸上升?？赡苁且?yàn)榈孜餄舛容^低時(shí)，體系內(nèi)右旋糖酐蔗糖酶加入量（0.5U/mL）相對(duì)充足，酶分子能催化大部分底物蔗糖而使其轉(zhuǎn)化率高，但繼續(xù)增大底物濃度時(shí)，相對(duì)酶分子量減少，酶催化速率降低，并且高濃度蔗糖溶液抑制右旋糖酐的合成，因此使蔗糖轉(zhuǎn)化率也降低。此外，在一定范圍內(nèi)，右旋糖酐的產(chǎn)量與底物濃度呈正相關(guān)，適應(yīng)增加底物濃度有助于提高右旋糖酐的產(chǎn)量。所以通過增加底物濃度并不能提升蔗糖的轉(zhuǎn)化率，但相對(duì)于低濃度底物蔗糖溶液，增加底物濃度可以相對(duì)地提高產(chǎn)量。

在底物蔗糖溶液不變的情況下，蔗糖的轉(zhuǎn)化率與右旋糖酐產(chǎn)量均隨著右旋糖酐蔗糖酶加入量的增加而增加，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。由酶促反應(yīng)機(jī)制可知，酶濃度與反應(yīng)速率成正比，酶加入量越多，體系中相對(duì)的酶活性位點(diǎn)也越多，催化蔗糖的能力越強(qiáng)。底物蔗糖溶液不變時(shí)，增加酶量使合成反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行且反應(yīng)相對(duì)完全，則蔗糖的轉(zhuǎn)化率和右旋糖酐的產(chǎn)量也越大。但由于體系中蔗糖濃度（0.1mol/L）較低，因此聚合而成的右旋糖酐含量也相對(duì)較少。

2.4 右旋糖酐酶的介入時(shí)間對(duì)右旋糖酐分子量及分子量片段的調(diào)控作用

由2.1研究可知，單酶體系中合成的產(chǎn)物右旋糖酐分子量均在百萬(wàn)級(jí)別（Mw＞106Da），在一定范圍內(nèi)通過設(shè)置不同的參數(shù)變化也很少獲得中小分子量的右旋糖酐，因此單酶體系難以有效地調(diào)節(jié)右旋糖酐的分子量及其分布，同時(shí)也看出單酶法制備特定分子量右旋糖酐的瓶頸。因此，在單酶反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上引入右旋糖酐酶（分解酶），通過右旋糖酐酶的特性達(dá)到調(diào)控產(chǎn)物右旋糖酐聚合過程的目的，更深一步探討雙酶合成過程中兩種酶對(duì)右旋糖酐聚合過程的影響規(guī)律。

圖1 不同時(shí)間下加入右旋糖酐酶對(duì)右旋糖酐分子量的影響Fig.1Effect of dextranase at different intervention time on the molecular weight of dextran

由圖1可知，隨著介入時(shí)間的增大，雙酶體系各系列聚合的右旋糖酐分子量呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，但總體上產(chǎn)物右旋糖酐分子量要小于單酶法合成的右旋糖酐分子量。由于樣品數(shù)量較多，右旋糖酐酶介入時(shí)間最長(zhǎng)為16h，為了更好地研究右旋糖酐酶不同介入時(shí)間對(duì)反應(yīng)過程的影響規(guī)律，以18h之后取樣為代表。右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶同時(shí)間加入時(shí)，反應(yīng)中產(chǎn)物右旋糖酐的整體平均分子質(zhì)量最低，隨著反應(yīng)的進(jìn)行分子質(zhì)量降低趨勢(shì)平緩；而同一反應(yīng)時(shí)間下，隨著右旋糖酐酶介入時(shí)間的延長(zhǎng)，最終合成的右旋糖酐分子質(zhì)量不斷增加。同時(shí)將兩種酶加入體系對(duì)右旋糖酐的分子質(zhì)量控制最明顯，適合制備分子量小于105Da的代血漿用品及益生元；而加入時(shí)間為4～16h時(shí)主要合成分子量在105～106Da范圍內(nèi)的右旋糖酐產(chǎn)品，主要作為食品調(diào)味品、添加劑使用。在反應(yīng)過程中，右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶兩者共同作用，右旋糖酐蔗糖酶發(fā)揮聚合作用合成高分子質(zhì)量右旋糖酐后，右旋糖酐酶則利用分解能力立即對(duì)其進(jìn)行降解，使體系中大分子右旋糖酐的分子質(zhì)量不斷降低。因此，右旋糖酐酶從反應(yīng)一開始就發(fā)揮了分解作用，中斷了右旋糖酐多鏈不斷延伸的過程，體系中糖鏈混合物的平均分子量整體處于較低水平且變化平緩，趨向于合成低聚右旋糖酐。

分子量變化曲線的斜率也可以間接地反映右旋糖酐酶的分解催化速率，右旋糖酐酶加入到單酶體系中的時(shí)間越晚，體系中右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖生成的右旋糖酐分子量越大，而右旋糖酐酶切斷右旋糖酐糖鏈的α－（1，6）糖苷鍵的速率越快，因此右旋糖酐酶對(duì)右旋糖酐的親和性與其分子量呈正相關(guān)；同時(shí)，曲線的變化說明后加入右旋糖酐酶的反應(yīng)體系降解作用不完全。但是因?yàn)橛倚囚崽敲负铣蛇^程中除了生成產(chǎn)物右旋糖酐，體系中還有底物蔗糖、副產(chǎn)物葡萄糖、果糖，由單酶實(shí)驗(yàn)可知反應(yīng)進(jìn)行到一定階段時(shí)，右旋糖酐蔗糖酶作為一種復(fù)合酶不再專一的聚合葡萄糖單元，而會(huì)聚合果糖單元形成低聚果糖，所以不適合延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。由于右旋糖酐酶的降解作用，雙酶法合成的右旋糖酐平均分子質(zhì)量比單酶合成的降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，改變了反應(yīng)體系中不斷聚合形成大分子量片段右旋糖酐的途徑。

圖2 不同時(shí)間下加入右旋糖酐酶對(duì)右旋糖酐分子量片段的影響Fig.2Effect of dextranase at different intervention time on the molecular weight distribution of dextran

由圖2可知，右旋糖酐酶加入到體系中的時(shí)間越晚，中等分子量片段（105Da＜Mw＜106Da）和大分子量片段（Mw＞106Da）所占比例越大，低分子量片段（Mw＜105Da）所占比例越?。划?dāng)反應(yīng)體系同時(shí)加入兩種酶時(shí)，低分子量片段（104Da＜Mw＜105Da）的比例占94.76%，且僅存在少量大于105Da和小于104Da的分子量片段，證明雙酶同時(shí)作用時(shí)更有利于合成低分子量右旋糖酐。隨著介入時(shí)間的縮短，中等分子量片段（104Da＜Mw＜105Da）和大分子量片段（Mw＞106Da）所占比例不斷減少，說明右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖聚合產(chǎn)生的大分子量右旋糖酐釋放到體系后，會(huì)被優(yōu)先地隨機(jī)切割，降解為小分子量片段。根據(jù)2.1可知，單酶體系的中小分子量片段右旋糖酐所占比例極少，但引入右旋糖酐酶后其所占比較逐漸增加，證明通過調(diào)控右旋糖酐酶的作用時(shí)間可制備不同分子量的右旋糖酐。

2.5 雙酶酶活比對(duì)右旋糖酐分子量及分子量片段的影響

圖3 雙酶酶活比對(duì)右旋糖酐分子量的影響Fig.3Effect of different enzyme activity ratios on the molecular weight of dextran

由圖3可知，整體上右旋糖酐分子量隨著雙酶酶活比的增大而減小。體系中的右旋糖酐酶優(yōu)先對(duì)產(chǎn)物大分子量右旋糖酐進(jìn)行酶降，從而使其分解為小分子量右旋糖酐；而右旋糖酐酶的添加量越多，對(duì)右旋糖酐糖鏈的降解機(jī)會(huì)也就越多，因此整體上產(chǎn)物右旋糖酐分子量減小。同時(shí)，在不同雙酶酶活比的反應(yīng)體系中，合成的右旋糖酐分子量在反應(yīng)前8h均不斷上升，之后分子量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明雙酶體系中反應(yīng)前期以右旋糖酐蔗糖酶的聚合作用為主，而反應(yīng)后期以右旋糖酐酶分解作用為主。因此，雙酶法合成右旋糖酐可獲得分子量比單酶法小一個(gè)數(shù)量級(jí)以上的右旋糖酐，實(shí)現(xiàn)了對(duì)右旋糖酐總體分子質(zhì)量的控制。

圖4 雙酶酶活比對(duì)右旋糖酐各分子量片段的影響Fig.4Effect of different enzyme activity ratios on the molecular weight distribution of dextran

由圖4可知，隨著雙酶酶活比的增加，中等分子量片段（105Da＜Mw＜106Da）右旋糖酐逐漸降低，而低分子量片段（104Da＜Mw＜105Da）右旋糖酐先增加后降低。當(dāng)雙酶酶活比為0.08∶1時(shí)，體系存在較多中大分子量片段和小分子量片段右旋糖酐。在雙酶酶活比為0.10∶1時(shí)，低分子量片段右旋糖酐（104Da＜Mw＜105Da）所占比例最大，達(dá)到96.63%，此時(shí)樣品中大分子質(zhì)量右旋糖酐在右旋糖酐酶的酶解作用下大部分被隨機(jī)切割，而小分子質(zhì)量右旋糖酐鏈不斷延長(zhǎng)，體系向104Da＜Mw＜105Da分子量片段這一區(qū)域集中。但雙酶酶活比超過0.10∶1后，右旋糖酐酶分解能力增加，體系中小分子質(zhì)量右旋糖酐（Mw＜104Da）所占比例上升。因?yàn)槊富畋仍龃笫狗磻?yīng)體系的降解能力加強(qiáng)，右旋糖酐酶接觸右旋糖酐鏈的機(jī)會(huì)變多，使右旋糖酐鏈不斷被分解成低分子量質(zhì)量右旋糖酐。對(duì)比單酶體系反應(yīng)結(jié)果可知，產(chǎn)物右旋糖酐的分子量片段在104Da＜Mw＜105Da這一區(qū)間集中的原因是右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶共同作用的結(jié)果，兩者相互競(jìng)爭(zhēng)和促進(jìn)作用使高分子質(zhì)量右旋糖酐實(shí)現(xiàn)了聚合物降解和生物功能化，制備出利用價(jià)值高和經(jīng)濟(jì)效益好的右旋糖酐產(chǎn)品。

3 結(jié)論

通過構(gòu)建單酶體系及雙酶體系合成產(chǎn)物右旋糖酐，以探索酶法合成不同分子量右旋糖酐的過程規(guī)律。結(jié)果表明：在單酶體系中，右旋糖酐分子量隨著底物蔗糖濃度的增加先增大后減小，隨著右旋糖酐蔗糖酶加入量的增大而增大；且右旋糖酐產(chǎn)量與蔗糖濃度和右旋糖酐蔗糖酶添加量呈正相關(guān)；蔗糖轉(zhuǎn)化率隨蔗糖濃度增大而減小，隨著右旋糖酐蔗糖酶加入量的增加而增大；但單酶法合成的右旋糖酐分子量較大，大多集中100萬(wàn)以上，低分子量片段右旋糖酐所占比例極少，主要適合大分子質(zhì)量右旋糖酐的合成。在此基礎(chǔ)上引入右旋糖酐酶構(gòu)建雙酶體系，發(fā)現(xiàn)隨著右旋糖酐酶介入時(shí)間的縮短，整體上聚合的右旋糖酐分子質(zhì)量呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)，同時(shí)間加入右旋糖酐酶和右旋糖酐蔗糖酶更有利于合成低聚右旋糖酐；隨著右旋糖酐酶加入時(shí)間的延長(zhǎng)，中等分子量片段（105Da＜Mw＜106Da）和大分子量片段（Mw＞106Da）右旋糖酐所占比例越大，而低分子量片段（104Da＜Mw＜105Da）右旋糖酐所占比例降低。在蔗糖濃度0.6mol/L、雙酶酶活比為0.10∶1時(shí)，分子量片段（104Da＜Mw＜105Da）右旋糖酐所占比例最大，達(dá)到96.63%。實(shí)驗(yàn)表明右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶的競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)同作用可有效地調(diào)控產(chǎn)物右旋糖酐分子量，為合成符合食品調(diào)味品、添加劑及醫(yī)藥等不同領(lǐng)域需求的右旋糖酐產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。