賈元玲，項敏泓，黃麗，李青松，文杭，詹月萍

結膜松弛癥（conjunctivochalasis,CCh）是年齡相關性眼病，隨著人口老齡化的加劇，患病率逐年上升?；颊叱霈F(xiàn)不同程度的角膜炎、瞼板腺炎、干眼及相關的眼表炎癥。Mimura等[1]調查東京醫(yī)科大學醫(yī)院就診1~94歲共1416例人群中CCh患病率為85.24%。Zhang等[2]對≥60歲社區(qū)老年人調查發(fā)現(xiàn)CCh患病率為39.01%。Pearson[3]發(fā)現(xiàn)在各類眼表疾病中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路對介導炎癥和調控細胞凋亡起著一定的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)隨著CCh病程的加重，松弛結膜組織中MAPK信號通路中的細胞外信號調節(jié)激酶 （extracellular signal-regulated kinases,ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及p38 MAPK蛋白表達均有所增強[4]，中藥杞精明目湯治療CCh取得了較好效果[5]。因此本研究旨在進一步通過細胞實驗探討杞精明目湯是否通過MAPK信號通路發(fā)揮調控作用，為臨床上應用該方治療CCh提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1組織標本研究用結膜組織來自于2016年4月—2017年1月在上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院眼科確診為CCh，且符合手術適應癥行新月形松弛結膜切除術的CCh的患者[6]，共7例（7只眼），診斷標準參照文獻[7]。其中Ⅱ級2只眼、Ⅲ級3只眼、Ⅳ級 2 只眼。 年齡 59～82 歲，平均（69.43±8.24）歲。 取材是由同一術者采用相同的方法采集，研究方案已通過上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院倫理委員會批準，并對所有患者進行知情同意。

1.1.2實驗動物雄性SD大鼠30只，普通級（CV），體質量（200±20） g（上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院中心實驗室動物房提供）。

1.1.3藥物杞精明目湯：黃精20 g、麥冬20 g、旱蓮草 15g、枸杞子 15g、茯苓 10g、川芎 3g、炙甘草 3g。根據(jù) “人和動物之間按體表面積折算的等效計量比值”計算出與70 kg成人用藥量相當?shù)?00 g大鼠的等效計量，將藥液濃縮為含生藥3.35 g/ml，于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹8]。

1.1.4主要試劑DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco公司）、0.25%胰蛋白酶溶液、牛血清白蛋白（BSA）（美國 Sigma公司）。 Trizol、cDNA 第一條鏈合成試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（日本 Takara公司）；p38 MAPK、JNK、ERK 的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Abcam公司，貨號 ：ab176664、ab176662、ab176660）；抗 體p38 MAPK、p-p38 MAPK（磷 酸 化 p38 MAPK）、JNK、p-JNK （磷酸化 JNK）、ERK、p-ERK （磷酸化 ERK）、β-actin（美國 CST 公司，貨號：#4695、#4370、#9252、#9251、#8690、#4511、4967S），辣 根 過 氧 化 物 酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、BeyoECL Plus（上海碧云天公司）；引物、熒光探針p38 MAPK、JNK、ERK、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（上海生工公司）。

1.1.5主要儀器CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），倒置顯微鏡（德國WILOVERT公司），低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），熒光定量 PCR儀 ABI7300（美國ABI公司），標檢測儀、垂直電泳槽、轉膜儀（美國BIO-RAD公司），化學發(fā)光分析系統(tǒng)儀（中國培清公司）。

1.2　實驗方法

1.2.1人結膜成纖維細胞培養(yǎng)切取松弛結膜組織平鋪于6孔板內，將6孔板翻轉為底朝上，然后置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，待組織塊周邊接近干燥（約1~3 min）將6孔板翻轉，于超凈臺中緩慢加入3 ml含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，勿使組織浮起，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及培養(yǎng)情況[9]。

1.2.2藥物血清的制備及實驗分組實驗共分3組：分別為CCh+20%含藥血清組 （簡稱含藥血清組）、CCh+20%無藥血清組（簡稱無藥血清組）、CCh對照組。將30只SD大鼠編號，按隨機數(shù)字表分為含藥血清組和無藥血清組，每組15只。含藥血清組予杞精明目湯灌胃，無藥血清組予生理鹽水灌胃，均每次2 ml/只，每日2次，連續(xù)5 d。最后1次灌胃2 h后 （灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥鈉1.5 ml/kg腹腔麻醉后，消毒，無菌操作下打開腹腔，腹腔動脈采血，靜置2 h，2000 r/min離心25 min，無菌操作下分離出血漿，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm過濾器過濾后-20℃下保存?zhèn)溆?。臨用前用含1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液配制成20%的含藥或無藥血清。

1.2.3藥物血清干預實驗選擇3～6代80%融合的對數(shù)生長期CCh成纖維細胞．將細胞培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入20%含藥或無藥血清的細胞全培養(yǎng)基，同時設PBS陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)至4 h分別提取各組的RNA用于反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR,RT-PCR）檢測，剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h提取蛋白質，用于Western Blot實驗。

1.2.4ELISA檢測選取3～6代呈對數(shù)生長期細胞，將生長至90%的細胞棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，并加入試劑盒中的裂解液500 μl裂解細胞，離心后取上清液，置于無菌EP管中，分裝后-80℃冷凍保存，ELISA試劑盒檢測p38 MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 的相對濃度，酶標儀在 450 nm波長處檢測，測量各孔的光密度D（450 nm），重復3次。

1.2.5Western Blot檢測BCA法檢測蛋白濃度，并調整各組蛋白濃度至同一水平，蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白：蛋白上樣量取20 μg，上層膠5%，下層膠10%，上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V，垂直電泳1.5 h，濕轉膜2 h，電流300 mA，將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA室溫封閉 2 h，4℃孵育一抗過夜，用TBTS洗滌3次，每次10 min。HRP標記的抗兔IgG二抗室溫孵育對應的一抗1h，用TBTS洗滌3次，每次10 min，增強化學發(fā)光法（ECL）曝光，化學發(fā)光分析系統(tǒng)儀拍照。以β-actin為內參，采用Image J分析軟件對條帶進行半定量分析，計算p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋白的相對表達量，重復3次。

1.2.6RT-PCR檢測以oligd（T）18為引物，mRNA模板1 μg，合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR按20 μl反應體系進行：10×PCR 緩沖液 10 μl，上游引物 1 μl， 下游引物 1 μl， 熒光探針 1 μl，cDNA 1 μl，PCR級ddH2O 6 μl。樣品和內參均設復孔，引物探針由上海生工生物工程有限公司合成，引物探針序列見表 1。 反應條件為：①95℃1min，95℃30s，60℃30s，共40個循環(huán)，ABI7300全自動熒光定量PCR儀。反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為CT值；②目的基因相對表達水平的計算：直接用樣品的各自內源控制物GAPDH的表達來標準化加入的初始RNA量，即每個樣品的靶基因的相對表達水平△Ct值=靶基因Ct值-GAPDH的Ct值；通過比較不同組的△△Ct值=△Ct1-△Ct2，計算 2-△△Ct值，間接反映各組模板的起始拷貝數(shù)之間的倍數(shù)關系，重復 3次。

表1　RT-PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.3　統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　結膜成纖維細胞生長情況

收集的結膜組織塊，貼壁培養(yǎng)3～6 d后，可觀察到組織塊呈暗色遮光區(qū)域，透亮性差，組織周圍有細胞爬出，細胞體積較大，以梭形為主，也可見不規(guī)則三角形狀；培養(yǎng)20 d左右可匯合成單層貼壁細胞，利用差速貼壁法，用胰酶消化，待成纖維細胞變圓并部分脫壁時，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成細胞懸液，分瓶接種，2～3代后可得到純度較高的成纖維細胞。處于對數(shù)生長期的細胞，緊密連接，排列較為規(guī)則，為纖維樣細胞，大小均一，呈放射狀、編織狀排列，細胞核呈卵圓形，細胞間互相交聯(lián)。經(jīng)過倒置顯微鏡對細胞形態(tài)觀察，免疫熒光和流式細胞術對培養(yǎng)的CCh結膜成纖維細胞進行特異性蛋白檢測，鑒定為成纖維細胞后用于后續(xù)實驗（圖1）。

圖1　倒置顯微鏡下觀察結膜成纖維細胞。1A.原代培養(yǎng)3～6 d后，觀察組織塊呈暗色遮光區(qū)域，透亮性差，組織周圍有細胞爬出，細胞體積較大，以梭形為主，也可見不規(guī)則三角形狀；1B.為處于對數(shù)生長期的細胞，細胞緊密連接，排列較為規(guī)則，為纖維樣細胞，大小均一，呈放射狀、編織狀排列，細胞核呈卵圓形，細胞間互相交聯(lián)

2.2　ELISA 檢測 p38 MAPK、JNK、ERK（圖 2）

p38 MAPK與p-p38 MAPK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK光密度值分別為2.44±0.33、3.34±0.43、3.92±0.76 （單因素方差分析，F(xiàn)=5.772，P=0.040）；p-p38 MAPK 的光密度值分別為0.11±0.03、0.13±0.02、0.17±0.01（F=6.741，P=0.029）。含藥血清組p38 MAPK、p-p38 MAPK的光密度值明顯低于 CCh 對照組（P=0.015，P=0.011），無藥血清組與CCh對照組的p38 MAPK及p-p38 MAPK差異無統(tǒng)計學意義（P=0.233，P=0.075）。

JNK與p-JNK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK光密度值分別為 1.79±0.09、1.91±0.06、1.96±0.02（F=5.665，P=0.041）；p-JNK 的光密度值分別為 0.23±0.02、0.24±0.02、0.28±0.01（F=9.451，P=0.014）。含藥血清組的JNK、p-JNK光密度值較CCh 對照組明顯降低（P=0.017，P=0.023），無藥血清組JNK光密度值與CCh對照組接近 （P=0.376），p-JNK光密度值低于CCh對照組（P=0.006）。

圖2　ELISA檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 表達的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，與CCh對照組比較，*P<0.05；與無藥血清組比較，▲P<0.05?！LISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗　CCh：結膜松弛癥　MAPK：絲裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶　ERK：細胞外信號調節(jié)激酶p-：磷酸化

圖3　Western Blot檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋 白表達量的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK法，*P＜0.05 CCh：結膜松弛癥 MAPK：絲裂原活化蛋白激酶JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：細胞外信號調節(jié)激酶　p-：磷酸化

ERK與p-ERK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的ERK光密度值分別為 2.41±0.03、2.85±0.04、2.94±0.01（F=288.107，P＜0.001）；p-ERK 的光密度值 分別 為 1.44±0.12、1.75±0.09、1.82±0.14 （F=8.519，P=0.018）。含藥血清組ERK與p-ERK光密度值均低于 CCh 對照組（P＜0.001，P=0.008），無藥血清組ERK、p-ERK光密度值與CCh對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.051，P=0.511）。

2.3　Western Blot檢測 p38 MAPK、JNK、ERK 蛋白表達（圖3）

p38 MAPK與p-p38 MAPK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK蛋白相對表達量分別為 0.75±0.36、1.21±0.65、1.67±0.72，差異無統(tǒng)計學意義（F=1.756，P=0.251）。 各組 p-p38 MAPK 蛋白相對表達量分別為 1.13±0.14、1.15±0.19、1.75±0.33，含藥血清組、無藥血清組數(shù)值明顯低于CCh對照組（P=0.019，P=0.017），且以含藥血清組 p38 MAPK 蛋白磷酸化水平下調更為明顯。

JNK與p-JNK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的JNK蛋白相對表達量分別為1.69±0.84、2.12±0.50、2.74±0.59，差異無統(tǒng)計學意義（F=1.953，P=0.222）。三組p-JNK蛋白相對表達量分別為0.98±0.69、1.23±0.84、1.76±1.22， 組間差異亦無統(tǒng)計學意義（F=0.537，P=0.610）。

ERK與p-ERK：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的ERK蛋白相對表達量分別為1.42±0.60、1.84±0.49、2.19±0.70，組間差異無統(tǒng)計學意義 （F=1.210，P=0.362）。三組p-ERK蛋白相對表達量分別為 0.69±0.14、1.10±0.30、2.46±0.29 （F=39.380，P＜0.001），含藥血清組、無藥血清組數(shù)值較CCh對照組明顯降低（P=0.001，P＜0.001），且含藥血清組的 ERK蛋白磷酸化水平下調更為明顯。

2.4　RT-PCR 檢測 p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 表達（圖 4）

p38 MAPK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的p38 MAPK mRNA表達量分別為0.19 ±0.12、0.33 ±0.11、1.00 ±0.00（F=62.001，P ＜0.001），含藥血清組、無藥血清組的p38 MAPK mRNA表達量均明顯低于 CCh對照組 （P＜0.001，P＜0.001），可見無藥血清和含藥血清皆可降低CCh的p38 MAPK mRNA的表達，而20%杞精明目湯含藥血清對p38 MAPK mRNA水平下調更為明顯。

JNK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK mRNA表達量分別為 0.40±0.20、0.44±0.15、1.00±0.00 （F=16.214，P=0.004）， 前兩組 JNK mRNA表達較CCh對照組明顯下降 （P=0.003，P=0.002），其中20%杞精明目湯含藥血清對JNK mRNA水平下調更為明顯。

ERK mRNA：含藥血清組、無藥血清組、CCh對照組的 JNK mRNA表達量分別為 0.22±0.08、0.35±0.12、1.00±0.00 （F=74.035，P＜0.001）， 前兩組 JNK mRNA表達也較CCh對照組明顯下降（P＜0.001，P＜0.001），其中20%杞精明目湯含藥血清對ERK mRNA水平下調更為明顯。

圖4　RT-PCR檢測20%杞精明目湯對CCh結膜成纖維細胞p38 MAPK、JNK、ERK mRNA表達的影響。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，*P＜0.05 RT-PCR：反轉錄聚合酶鏈反應　CCh：結膜松弛癥MAPK：絲裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：細胞外信號調節(jié)激酶

3　討論

CCh是由于球結膜過度松弛和/或下瞼緣張力高，造成松弛球結膜堆積在眼球與下瞼緣、內、外眥部之間形成皺褶，引起眼表淚液學異常，常伴有眼部干澀、異物感、溢淚不適等癥狀的疾病，嚴重者影響視覺和生活質量，但是目前除手術外缺乏有效治療方法[10-11]。故將研究方向轉移到中醫(yī)領域，以期在中醫(yī)中藥領域尋求更為安全有效的治療方法。

CCh屬于中醫(yī)眼科學領域的“白澀癥”范疇，證型多為肝腎陰虛，臨床表現(xiàn)為眼內干澀不爽，雙目頻眨，羞明畏光，白睛隱隱淡紅，久視后諸癥加重。肝開竅于目，肝脈連目系，肝氣通于目，肝和則目能辨五色，淚為肝之液，肝陰不足，目失所養(yǎng)可致眼干澀不舒，治療多以補肝腎，養(yǎng)肝明目為主。我們在經(jīng)驗方的基礎上研制的杞精明目湯，方中黃精、枸杞子、麥冬滋補肝腎，養(yǎng)陰生津，補益先天精血，共為君藥；茯苓、炙甘草健脾益氣以助生化；陰虛生內熱，旱蓮草補肝腎之陰以清熱涼血；川芎上行頭目，引藥上行。全方滋補肝腎，培補先天之精血；健脾益氣，以助精血之生化。既往研究發(fā)現(xiàn)杞精明目湯在維護淚膜穩(wěn)定性的同時，可改善淚液中的黏蛋白，促進眼表組織損害的修復，改善淚液功能，從而治療CCh[12]。

MAPK是細胞內一類進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于自然界的大多數(shù)細胞中。它可以被細胞外的多種刺激因素或信號分子所激活，生理刺激如激素、生長因子、細胞因子等，病理性刺激如缺血再灌注，滲透壓的改變以及炎癥反應等。MAPK家族主要包含細胞外信號調節(jié)激酶（ERK），c-Jun 氨基末端激酶 （JNK），p38 MAPK 和ERK5/大絲裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase,BMK1）4條信號通路[13]。 研究證實在干眼等眼表疾病中，前三種信號通路對介導和調控炎癥因子起著一定的作用[14]。在干眼動物模型中，發(fā)現(xiàn)早期眼表上皮內即出現(xiàn)ERK、JNK以及p38 MAPK通路的活化，并出現(xiàn)了炎癥介質白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α） 以及基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的濃度增高[15]。CCh作為一種特殊類型的干眼，松弛結膜組織存在ERK、JNK及p38 MAPK蛋白表達增強[4]。本研究結果證實20%杞精明目 湯 含 藥 血 清 對 p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的蛋白表達和基因轉錄均具有調控作用，尤其是20%杞精明目湯含藥血清能夠顯著抑制p38 MAPK、ERK蛋白的磷酸化水平和p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 的表達（P＜0.05），這就進一步從實驗層面證明了杞精明目湯治療CCh的有效性，可能通過干預MAPK信號通路中的關鍵分子從而治療CCh。

對杞精明目湯的中藥成分進行分析發(fā)現(xiàn)多味中藥皆有不同程度的抗炎作用且與MAPK信號通路相關：枸杞多糖與炎癥介質和MMPs的表達密切相關[16]，且能顯著抑制紫外線 B（UVB）誘導的p38 MAPK激活，逆轉半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspases-3）的活化和MMP-9的表達[17]，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶（PI3K/Akt）信號通路調節(jié)JNK的磷酸化水平[18]。黃精多糖能降低實驗性動脈粥樣硬化家兔血清IL-6及C反應蛋白（CRP）水平[19]，可減輕炎癥反應，提高氧自由基清除能力[20]。麥冬能促進細胞的生長增殖，促進生長因子釋放，抑制炎癥反應[21]，通過抑制TNF-α的水平進一步抑制p38 MAPK的活化[22]。茯苓多糖化合物具有抗炎作用，其作用機制主要是抑制脂多糖誘導的巨噬細胞相關基因的表達，并抑制細胞外信號分子介導的ERK、JNK基因的表達[23]。炙甘草可降低血清MMP-9及MMP-9/TIMP-1（金屬蛋白酶組織抑制劑-1）的表達[24]，并顯著降低血清 TNF-α 的水平[25]。

由于CCh松弛結膜組織中MAPK相關信號通路蛋白表達明顯增強，提示MAPK信號通路參與了CCh的發(fā)展過程[4]，且在CCh中熱休克蛋白27（heat shock protein 47,HSP27）表達上調[26]，熱休克蛋白可進一步激活ERK和JNK信號通路使MMP-1和MMP-3的表達增加[27]。MAPK信號通路可以通過激活各種靶細胞的 TNF-β和激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）等轉錄因子調控MMPs的數(shù)量和活性[28]。因此我們猜測MAPK通路被磷酸化激活后作用于MMPs等底物，可能導致了CCh的發(fā)生與發(fā)展。本研究通過細胞實驗證實MAPK通路參與了CCh的發(fā)病過程，而20%杞精明目湯含藥血清可以顯著抑制CCh成纖維細胞MAPK信號通路相關蛋白及基因的表達，可能減少MMPs的產(chǎn)生，起到了治療CCh的功效。杞精明目湯含藥血清對MAPK信號通路的干預作用是通過多途徑實現(xiàn)的，包括調節(jié)MAPK信號通路相關蛋白的磷酸化水平、抑制炎癥因子表達、減少致纖維化因子表達等。由于本實驗是采用含杞精明目湯全方的藥物血清進行干預研究，含有君臣佐使的各種成分，故不能斷定是藥物相互協(xié)同起效，還是某味藥物或其單體的作用，尚需進一步研究明確。