吳英健，龐　璐，李　敏，黎亮星*

(1.中國廣州分析測試中心，廣東 廣州　510070；2.廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州　510070)

枸杞子為常用臨床中藥，為茄科植物寧夏枸杞 Lycii barbarum L.的干燥成熟果實。性甘、平，歸肝、腎經(jīng)；具有滋補肝腎，益精明目的功效，用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，陽痿遺精，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明[1]?，F(xiàn)代研究表明，枸杞子具有調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能、提高機體造血功能、提高生殖能力、降血糖、退熱、保護肝臟、延緩衰老作用[2-3]。

甜菜堿為枸杞子的主要功效成分，目前枸杞子中甜菜堿含量的測定方法主要包括比色法[4]，非水滴定法[5]，薄層掃描法[1，6-7]，離子色譜法[8]，高效液相色譜法[9-12]，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[13]。比色法、非水滴定法雖然成本低，但操作費時，容易受到干擾，靈敏度低。薄層掃描法前處理復(fù)雜，且重復(fù)性較差。離子色譜法能準(zhǔn)確測定枸杞子中甜菜堿的含量，但樣品處理需要脫色以及除去蛋白質(zhì)，使前處理變得復(fù)雜。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然能保證靈敏度，但成本太高。高效液相色譜法是測定甜菜堿含量最常用的方法，使用紫外檢測器時通常用192nm作為檢測波長，容易受到干擾，而使用蒸發(fā)光散射檢測器時重復(fù)性較差，靈敏度較低。

電噴霧檢測器(Charged Aerosol Detection，CAD)是一種新型的通用檢測器，靈敏度、重現(xiàn)性、線性均優(yōu)于蒸發(fā)光散射檢測器。所以本文的目的是建立一種高效液相色譜-電噴霧檢測器分析的方法用于測定枸杞子中甜菜堿含量。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試劑和原料

甜菜堿對照品(含量97.1%，中廣測)；乙腈(色譜純)；甲醇(分析純)；甲酸(色譜純)；所用水均為一級水；枸杞子(購自當(dāng)?shù)厮幍?。

1.1.2儀器和設(shè)備

UltiMate3000型高效液相色譜儀(配電噴霧檢測器，Thermo Fisher Scientific公司)；Millipore超純水器(明澈-D24UV)；SQP分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；HH-6J數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋(金壇市城東盛聯(lián)實驗儀器廠)。

1.2　方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：安捷倫Poroshell 120 Hillic(3.0mm×150mm，2.7μm)；柱溫30℃；流速0.5mL/min，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20)；進樣量：10μL；Corona Ultra CAD檢測器，霧化氣為氮氣(純度99.0%以上)，霧化室溫度30℃，霧化氣壓200kPa，采樣頻率10Hz，過濾模式設(shè)為3，等度洗脫。

1.2.2對照品溶液配制

稱取甜菜堿對照品139.55mg，精密稱定，至25mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得甜菜堿對照品溶液。

1.2.3供試品溶液的配制

將樣品剪碎，取2g，置錐形瓶中，加甲醇60mL，加熱回流1h，放冷，過濾至100mL容量瓶中，用甲醇30mL分次洗滌殘渣和容器，洗液濾入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得供試品溶液，通過0.45μm濾膜過濾后，待測。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取甜菜堿對照品溶液5.0mL，至25mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，再分別吸取1.0mL、1.0mL、2.0mL、2.5mL、5.0mL，分別至50mL、10mL、10mL、10mL、10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。甜菜堿的濃度為21.68μg/mL、108.4μg/mL，216.8μg/mL、271.0μg/mL、542.0μg/mL。

1.2.5樣品含量測定及精密度實驗

照上述“1.2.1”的色譜條件，測定“1.2.3”項的供試品溶液。同一樣品連續(xù)進樣6次，6次結(jié)果的平均值為樣品的結(jié)果。

1.2.6加標(biāo)回收率試驗

取已知甜菜堿含量的枸杞子樣品，剪碎，置錐形瓶中，取9份樣品，分為高、中、低濃度3組，每組3份，按高、中、低濃度分別加入甜菜堿對照品溶液1.5mL、1.0mL、0.5mL，照“1.2.3”方法制備供試品溶液，照前述色譜條件測定，計算回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1　儀器條件優(yōu)化

在其他色譜條件不變的情況下，使用乙腈-水(80∶20)作為流動相，甜菜堿的色譜峰出現(xiàn)比較明顯的拖尾現(xiàn)象，改用乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20)作為流動相后，色譜峰的拖尾現(xiàn)象得到明顯的改善，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液(80∶20)為流動相。

2.2　對照品及樣品的高效液相色譜圖

圖1為甜菜堿對照品的色譜圖，1號峰為甜菜堿，保留時間為6.691min；圖2為枸杞子供試品的色譜圖，1號峰為甜菜堿，保留時間為6.696min，結(jié)果表明，樣品色譜圖中，甜菜堿出峰時間快，且無雜峰干擾，分離效果良好。

圖1甜菜堿色譜圖(對照品)

圖2　供試品色譜圖(枸杞子)

2.3　線性范圍

取“1.2.4”項下的甜菜堿對照品溶液，在上述的色譜條件下測定，以甜菜堿濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以甜菜堿峰面積的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程為Y=0.7078X-0.39889，r=0.9999，結(jié)果表明，甜菜堿在21.68～542.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4　精密度試驗

取同一供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算得RSD為1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5　重復(fù)性試驗

用同一枸杞子樣品按照“1.2.3”方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，測得甜菜堿的平均含量為0.73%，RSD為1.3%。

2.6　加標(biāo)回收率試驗

按照上述色譜條件，測定“1.2.6”項下制備的供試品溶液，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1　加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=3)

2.7　方法對比

在其他色譜條件不變的情況下，采用二極管陣列檢測器，波長設(shè)定為192 nm，取“1.2.3”下的供試品溶液進行分析，色譜圖見圖3，甜菜堿的色譜峰附近有明顯的雜峰干擾。結(jié)果表明，相比二極管陣列檢測器，CAD更適合測定枸杞子中甜菜堿的含量。

圖3枸杞子的色譜圖(DAD檢測器)

3　結(jié)論

本試驗建立了高效液相色譜-電噴霧檢測器測定枸杞子中甜菜堿含量的方法。該方法前處理簡捷，結(jié)果準(zhǔn)確。采用安捷倫Poroshell 120 Hillic色譜柱(3.0mm×150mm，2.7μm)，分析時間較短，分離效果良好，樣品中甜菜堿峰附近無雜峰干擾。通過添加不同濃度的甜菜堿對照品溶液，其回收率為91.1%～95.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.6%，精密度和重復(fù)性良好，該方法可作為枸杞子中甜菜堿含量測定方法。