姚佳欣陳詩(shī)言劉青松蘇敏張大鵬

(1.川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，四川 南充 637000; 2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 四川 南充 637000；3. 什邡市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 四川 德陽(yáng) 618400)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球已婚夫婦不孕不育的比例高達(dá)10%～15%，其中男性原因引起的不育約占50%[1-2]。少精弱精癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。少精弱精癥的病因不明，可能與精索靜脈曲張、睪丸發(fā)育受阻、染色體畸變及相關(guān)基因突變等有關(guān)。研究表明，在人類精子形成過(guò)程中，基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平的改變(基因突變或易感性)會(huì)影響相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致精子發(fā)生障礙[3-4]。其中精子DNA損傷將影響精子受精能力、受精卵分裂以及胚胎發(fā)育[5]。當(dāng)精子DNA損傷后，與DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因多態(tài)性也可能會(huì)影響其功能，導(dǎo)致不同個(gè)體修復(fù)能力有所差異，最終影響男性生育力[6]。

X射線交叉互補(bǔ)修復(fù)基因1(X-rayrepaircrosscomplementing1,XRCC1)是一種重要的DNA堿基切除修復(fù)基因[7]，通過(guò)編碼蛋白質(zhì)與DNA連接酶Ⅲ相互作用，修復(fù)DNA單鏈斷裂[5]。該基因rs25487位點(diǎn)G→A與無(wú)精癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在爭(zhēng)議。有研究表明，外周血XRCC1基因rs25487位點(diǎn)G→A與陜西回族[8]和漢族[4]人群的無(wú)精癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，認(rèn)為AA基因型可增加無(wú)精癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；也有研究認(rèn)為AA基因型可以減少特發(fā)性無(wú)精子癥的易感風(fēng)險(xiǎn)[7]。故本研究采用精子細(xì)胞DNA為研究對(duì)象，證明XRCC1基因rs25487位點(diǎn)G→A多態(tài)性與少弱精的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象少弱精患者來(lái)自川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2015年9月～2016年8月門診病例，所有病例經(jīng)精液常規(guī)檢查，按世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，均符合少弱精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：少精：精液量<2.0ml；弱精：MI (a+b級(jí)精子百分率)<50%。健康對(duì)照人群為隨機(jī)選自在同一醫(yī)院男性健康體檢者，且精液常規(guī)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常，無(wú)既往相關(guān)病史。共入選182例少弱精患者和73例健康正常男性 。少弱精患者的平均年齡為(30.62±6.15)歲，健康對(duì)照者的平均年齡為(29.18±5.01)歲。

1.2樣本收集精液標(biāo)本采集前，要求禁欲5～7 d，手淫法取精液于干燥消毒的量杯中，置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)液化，1h內(nèi)利用。精液分析完成后，經(jīng)4000 r/min離心10min，棄上清，留取沉淀物進(jìn)行DNA提取。

1.3精子基因組DNA提取采集精液沉淀物，利用血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行精子細(xì)胞DNA提取。參照試劑說(shuō)明書和通過(guò)兩次裂解及延長(zhǎng)消化時(shí)間至30min的改進(jìn)，提取精子細(xì)胞基因組DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4XRCC1基因rs25487位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)。XRCC1基因rs25487位點(diǎn)的上游引物：5′-TCA CAC CTA ACT GGC ATC TTC ACT-3′，下游引物：5′-CTC CTT CCC TCA TCT GGA GTA CC-3′，20μl擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含2×PCR Taq Green Master Mix 10μl，7μl Nuclease-Free Water和上、下游引物各0.5 μl(C=1. 0 mol/L)，DNA模板2 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓，0.5×TBE電泳緩沖液)20min，凝膠成像后分析結(jié)果。取8.5μl的PCR產(chǎn)物，加入1μl Buffer Tango和0.5μl限制性內(nèi)切酶MSPⅠ (Fermentas，Lithuania)，總體積10μl，37℃水浴孵育24h。酶切后，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100V，0.5×TBE電泳緩沖液)50min，凝膠成像后分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，精液常規(guī)分析結(jié)果采用隨機(jī)t檢驗(yàn)；XRCC1基因rs25487位點(diǎn)SNP多態(tài)性采用Chi-square檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1XRCC1基因rs25487位點(diǎn)遺傳多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳擴(kuò)增片段大小在330bp位置(圖1A)。限制性內(nèi)切酶酶切后，野生型產(chǎn)物GG基因型產(chǎn)生177、153bp兩個(gè)片段，突變純合子產(chǎn)物AA基因型只有330bp片段，突變雜合子產(chǎn)物GA基因型產(chǎn)生330、177、153bp3個(gè)片段(圖1B)。

圖1　XRCC1基因rs25487位點(diǎn)PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Figure 1　Electrophoresis diagram of the PCR products and enzyme-digested products of XRCC1 gene rs25487 site

注：A. PCR產(chǎn)物電泳圖，M：Marker Ⅲ，泳道1和2為正常組精子細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物，泳道3和4為少弱精患者精子細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物；B.酶切后產(chǎn)物電泳圖，M：50bp DNA Ladder Marker；泳道1和3為GG基因型，泳道2為AA基因型，泳道4為GA基因型

2.2XRCC1基因多態(tài)與精液質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析精液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，在相同的年齡階段，少弱精患者的精子濃度和精子活率顯著低于健康人群，精液的液化時(shí)間顯著增加，差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而精液量無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。不同基因型與精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系結(jié)果顯示，XRCC1基因Rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與精液量不存在關(guān)聯(lián)(P>0.05)，但與液化時(shí)間、精子活力和精子濃度存在顯著關(guān)聯(lián)。攜帶AA純合突變型個(gè)體與GG野生型相比，精子濃度和精子活力明顯降低，液化時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Table1Comparisonofclinicaldatabetweendifferentexperimentalgroups

　參數(shù)少弱精組(n=182)健康對(duì)照組(n=73)tP年齡(歲)30.62±6.1529.18±5.011.630.104精子濃度(×109/L)35.33±27.0678.98±40.399.7870.000精液量(ml)4.47±1.834.49±1.300.9150.361液化時(shí)間(min)47.33±21.0141.10±17.45-2.2190.004RP活率(×10-2)30.00±13.5763.78±9.8819.1360.000

表2　XRCC1基因Rs25487位點(diǎn)多態(tài)性與精液常規(guī)常見(jiàn)參數(shù)的關(guān)系Table 2　The correlations between the polymorphism of XRCC1 gene Rs25487 site and parameters of routine semen analysis

注：與野生型相比，①P<0.05

2.3XRCC1基因rs25487位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布情況與健康對(duì)照組相比，少弱精患者攜帶突變型基因型的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GG基因型個(gè)體相比，攜帶AA基因型的個(gè)體患少弱精癥的風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的7.84倍(95%CI低值為1.019)，說(shuō)明AA基因型是少弱精癥的易感因素。XRCC1基因rs25874位點(diǎn)兩種等位基因頻率G、A在少弱精組和健康對(duì)照組中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3　少弱精患者XRCCI基因 rs25487位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與健康對(duì)照組之間的相關(guān)性[n(×10-2)]Table 3　The correlation genotype and allele frequency of rs25487 with the normal group

3　討論

精液量、液化時(shí)間、精子濃度和精子活率是衡量精子質(zhì)量常用指標(biāo)，也是造成男性不育或生育力下降的主要原因。精漿是精子活動(dòng)的介質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，可中和陰道的酸性分泌物，以免影響精子活力，故精液量減少可導(dǎo)致精子活力低下；液化時(shí)間延長(zhǎng)或不液化可抑制精子活動(dòng)，從而減少受孕機(jī)會(huì)，其主要原因是前列腺分泌液化因子減少，導(dǎo)致蛋白水解酶缺乏[9]。精子濃度和精子活力可以直接反應(yīng)遺傳能力，如果二者下降可能同時(shí)伴有精子DNA損傷率上升，精漿活性氧升高，精子細(xì)胞凋亡率上升，精子形態(tài)的變化以及精子膜完整性下降[10]。本研究中，我們對(duì)少弱精患者和健康人群此兩種參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，精液量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但少弱精患者的液化時(shí)間顯著增加，精子濃度和精子活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

男性生殖是一系列復(fù)雜的生理過(guò)程，大約有2000多個(gè)基因參與此過(guò)程的調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，很多常染色基因參與和調(diào)節(jié)男性生殖過(guò)程[11]。XRCC1是第一個(gè)被分離出來(lái)的參與修復(fù)離子輻射所致?lián)p傷的哺乳類動(dòng)物的修復(fù)基因[12]。XRCC1基因定位于人類染色體19q13.2～13.3區(qū)域，大小為33kb，包含17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子[13]。研究表明，XRCC1基因位點(diǎn)rs25487與精子生成障礙可能相關(guān)。張健等通過(guò)對(duì)79例回族非梗阻性無(wú)精癥患者和82例對(duì)照組進(jìn)行XRCC1基因rs25487位點(diǎn)基因分型和等位基因頻率分析發(fā)現(xiàn)，GA與GA+AA基因型是非梗阻性無(wú)精癥的危險(xiǎn)因素，A等位基因突變?cè)诜枪Ｗ栊詿o(wú)精癥患者中的頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。提示XRCC1基因rs25478位點(diǎn)G→A可能與回族人群非梗阻性無(wú)精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)[8]。另有研究對(duì)該位點(diǎn)在特發(fā)性精子缺乏漢族人群中的研究發(fā)現(xiàn)同樣類似結(jié)果[4]。但也有研究認(rèn)為，與GG基因型相比，AA基因型可以減少特發(fā)性無(wú)精子癥的易感風(fēng)險(xiǎn)[7]。

在本研究中，我們選擇漢族少弱精患者為研究對(duì)象，采用精子DNA對(duì)XRCC1基因rs25487位點(diǎn)GG、AA、GA3種基因型頻率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，少弱精患者和對(duì)照組中XRCC1基因rs25487位點(diǎn)GG、AA、GA3種基因型頻率的分布存在顯著性差異(P=0.041)：與GG基因型相比，AA基因型患少弱精癥風(fēng)險(xiǎn)是GG基因型的危險(xiǎn)因素(OR=7.84，95%CI：1.019～60.365)，與其他一些腫瘤易感性的研究結(jié)論相似[14-15]；而兩種等位基因頻率G、A分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與之前報(bào)道不完全一致，其原因可能為研究對(duì)象不同和DNA來(lái)源不同。

外周血(體細(xì)胞)和生殖細(xì)胞(精子細(xì)胞)中DNA存在差異。外周血和精液都能夠檢測(cè)出DNA反應(yīng)遺傳性狀[16]，但精子發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，容易受到外部環(huán)境因素的影響而可能發(fā)生斷裂或突變[17]，常常能發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞與體細(xì)胞存在基因型的不同[18]。因此，精液能直觀地反映配子狀態(tài)，利用精液來(lái)提取DNA更有利于男性不育的病因研究和檢測(cè)[19]。同時(shí)研究表明，不育男性與正常男性精子在轉(zhuǎn)錄水平上存在重要區(qū)別[20]，且不育男性精子細(xì)胞內(nèi)某些相關(guān)基因的多態(tài)性將是不育診治研究的突破點(diǎn)。因此，本研究采用精子細(xì)胞DNA作為研究少弱精XRCC1基因rs25487位點(diǎn)多態(tài)性的結(jié)果更能直接說(shuō)明基因多態(tài)性與生精障礙的相關(guān)性。但是因精子遺傳物質(zhì)處于高度濃縮狀態(tài)，一直以來(lái)被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄沉默的細(xì)胞[19]，且精子DNA含非常豐富的魚精蛋白和組蛋白，且與魚精蛋白之間形成牢固的二硫鍵，導(dǎo)致精子DNA很難從核蛋白中分離[4]。研究表明，提取高質(zhì)量精液基因組DNA成功的關(guān)鍵因素是精子裂解液[19]及消化時(shí)間。然而市場(chǎng)上精子裂解液價(jià)格昂貴，造成眾多研究者采用外周血DNA替代精子DNA作為研究精子的對(duì)象。本研究采用血液基因組DNA提取試劑盒，通過(guò)兩次裂解及延長(zhǎng)消化時(shí)間，成功獲取精子DNA，獲得滿意的PCR產(chǎn)物和酶切效果。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，少弱精患者的精子濃度和精子活力顯著降低，液化時(shí)間顯著延長(zhǎng)，且XRCC1基因rs25487位點(diǎn)AA基因型是患少弱精癥遺傳的易感基因位點(diǎn)。