花彤彤　曹福亮　徐莉　郁萬文　薛源

(南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京，210037)

銀杏果作為藥食同源物，種仁中含有營(yíng)養(yǎng)成分如糖、蛋白質(zhì)等，藥用成分如黃酮、萜內(nèi)酯等[1]，廣受青睞。銀杏種仁內(nèi)含有氫氰酸、銀杏酸、銀杏酚酸、白果二酚、MPN和致敏蛋白等物質(zhì)[2-8]。食用銀杏果引起的中毒事件時(shí)有報(bào)道[9]。氫氰酸屬于劇毒類物質(zhì)，對(duì)人體危害較大，人吸入高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氰酸氣體會(huì)引起呼吸停止而死亡[10]。MPN作為一種抗維生素B6的神經(jīng)毒素，當(dāng)誤食時(shí)會(huì)引起嘔吐、休克等癥狀[5]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)銀杏果中氫氰酸和MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究較少，多集中于銀杏酸、銀杏酚酸、白果二酚和致敏蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究。本研究采用氰離子選擇電極和高效液相色譜檢測(cè)經(jīng)過微波加熱、豆油翻炒、沸水煮3種處理的8個(gè)無性系銀杏種仁中氫氰酸和MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來確定較為安全的銀杏種仁加工食用方法，降低中毒幾率，并比較8個(gè)無性系銀杏種仁中氫氰酸和MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)，篩選出質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的無性系，為優(yōu)良種質(zhì)資源的選擇提供一定的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

供試材料采自江蘇省邳州市陳樓鎮(zhèn)銀杏種質(zhì)資源圃。1990年，從全國(guó)主要的銀杏產(chǎn)區(qū)(江蘇、山東、廣西、貴州)引進(jìn)核用優(yōu)株枝條，用2～3 m高的5年生的實(shí)生幼樹作砧木，起始嫁接部位在1.8～2.0 m，每株砧木嫁接3～4根接穗，每個(gè)無性系嫁接3～6株。參試8個(gè)無性系的編號(hào)和母株原產(chǎn)地見表1。定植株行距為7 m×6 m，樹冠輪廓多為半圓形。2016年10月份采集銀杏果，每株嫁接樹分東西南北4個(gè)方向，每個(gè)方向采果20顆，混合所有采集的果實(shí)，去除外種皮后存放于陰暗、通風(fēng)的房間待用。

表1　無性系名稱及原產(chǎn)地

1.2　方法

1.2.1樣品的制備

取上述銀杏果，人工去除中種皮和內(nèi)種皮，取銀杏種仁。進(jìn)行以下4種實(shí)驗(yàn)處理，將處理后的銀杏種仁磨成粉，-80 ℃存放于冰箱中待用。

處理①豆油翻炒：取不同無性系銀杏種仁于熱鍋內(nèi)炒至表面金黃色，有裂紋，具香氣，凍干。

處理②沸水煮：取不同無性系銀杏種仁于鍋內(nèi)，加適量水煮20 min后取出，凍干。

處理③微波加熱：取不同無性系的銀杏種仁于微波爐中加熱2 min，具香氣，凍干。

對(duì)照：取不同無性系銀杏種仁直接凍干。

不同部位樣品制備：鑷子取出種仁中胚，將胚和胚乳凍干。凍干樣品磨成粉，-80 ℃存放于冰箱中待用。

1.2.2氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

通過酶解法將銀杏種仁中氰苷水解為氫氰酸和苯甲醛后，氫氰酸溶解在水中，直接用氰離子選擇電極檢測(cè)溶液中氰根離子的濃度，根據(jù)溶液中氰根離子的濃度計(jì)算銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11-15]。

1.2.3MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.2.3.1色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫20 min，流動(dòng)相A：6%～12%乙腈，流動(dòng)相B：水(5 mM KH2PO4+C5H11NaO3S，pH=2.8)；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃。

1.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取6 mg的MPN對(duì)照品，蒸餾水定容至100 mL。用0.45 μm濾膜過濾，配制不同質(zhì)量濃度系列(1、5、10、25、50、100 μg/mL)的MPN對(duì)照品溶液，經(jīng)HPLC檢測(cè)后，記錄峰面積(Y)后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到對(duì)照品的回歸方程。

MPN對(duì)照品的回歸方程為：Y=49 136X-26 674，R2=0.999 6。其中：Y為峰面積：X為對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)；R2為相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.3樣品液制備

精確稱取不同方法處理的銀杏種仁凍干粉各1 g。將1 g樣品置于50 mL試管中，加入20 mL蒸餾水，水浴鍋100 ℃提取2 h，濾紙過濾；濾渣加20 mL蒸餾水，水浴鍋中100 ℃提取2 h，過濾，合并提取液，蒸餾水定容至50 mL；用0.45 μm濾膜過濾，計(jì)算MPN的峰面積，根據(jù)外標(biāo)曲線求得MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3.4HPLC方法的精密度測(cè)定

取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積，計(jì)算其精密度。

1.2.3.5樣品加樣回收率測(cè)定

稱取已測(cè)定MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀杏種仁凍干粉1 g，4個(gè)重復(fù)，加一定量的MPN對(duì)照品，按照1.2.3.3方法處理樣品并檢測(cè)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與分析

2.1　生銀杏種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

銀杏種仁由胚乳和胚兩部分組成，經(jīng)過酶解的不同無性系生銀杏胚乳和胚中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都可以通過氰離子選擇電極來測(cè)定。銀杏胚中的氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是胚乳的11～16倍。由表2可知，不同無性系的銀杏胚乳和胚中的氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有極顯著差異(P<0.01)。由表3可知，不同無性系的銀杏胚乳中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著差異，在5.64～9.88 μg/g。其中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高為新村18號(hào)、長(zhǎng)興1號(hào)、正安3號(hào)、桂林6號(hào)、葉籽銀杏、正安1號(hào)、長(zhǎng)興4號(hào)、藤久郎，胚中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是新村18號(hào)為78.96 μg/g，最高的是藤久郎為158.37 μg/g。種仁中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的無性系為藤久郎，最低的無性系為新村18號(hào)。

表2　不同無性系生銀杏種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方差分析

表3　不同無性系生銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.2　生銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2.1HPLC色譜圖分析

從圖1可以看出，MPN對(duì)照品與銀杏種仁中提取物相同。圖2中MPN峰與其他雜峰得到了較好的分離，且基線穩(wěn)定。

圖1　MPN對(duì)照品的HPLC圖譜

圖2　銀杏胚乳提取物MPN的HPLC圖譜

2.2.2精密度試驗(yàn)

將MPN對(duì)照品溶液(10 μL)按照上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，根據(jù)對(duì)照品峰面積計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(須小于2%)為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3樣品加樣回收率

對(duì)HPLC測(cè)定方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了測(cè)定，根據(jù)1.2.3.5測(cè)定并計(jì)算MPN加樣回收率為94.1%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=1.16%(n=4)。由此可見，該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.4生銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

MPN作為一種抗維生素B6神經(jīng)毒素，具有高水溶性，用水作為提取溶劑提取的銀杏種仁中的MPN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表5?？芍?，不同無性系的銀杏種仁中MPN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著，在89.33～103.51 μg/g。其中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)由低到高為新村18號(hào)、桂林6號(hào)、正安1號(hào)、正安3號(hào)、藤久郎、長(zhǎng)興4號(hào)、長(zhǎng)興1號(hào)、葉籽銀杏，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的無性系為葉籽銀杏，最低的無性系為新村18號(hào)。

表4　不同無性系生銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)方差分析

表5　不同無性系生銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3　不同處理后銀杏種仁中氫氰酸和MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3.1不同處理后銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同處理的不同無性系銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可用氰離子選擇電極檢測(cè)得出。通過表6可見不同方法處理后銀杏種仁中的氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著差異(P<0.01)。由表7可知，經(jīng)過不同處理后，氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的趨勢(shì)相同，微波加熱和豆油翻炒后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，沸水煮后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。微波加熱處理后的銀杏種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，經(jīng)過微波加熱處理后的銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了3.8%～51%；豆油翻炒處理后的銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了1.4%～13%；沸水煮后的銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了0.6%～58%。不同無性系的銀杏種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間也有顯著性差異(P<0.01)，新村18號(hào)、長(zhǎng)興1號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，藤久郎質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表6　不同處理方法處理后不同無性系銀杏胚乳種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方差分析

表7　不同處理方法處理后不同無性系銀杏種仁中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3.2不同處理后銀杏種仁中MPN的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

銀杏種仁經(jīng)過不同處理后，其中MPN有所變化，由表8可知不同處理間有極顯著差異(P<0.01)，通過表9可知，豆油翻炒處理后的銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，是未處理的22%～41%；微波加熱處理后的銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)是未處理的0.9%～32%；而沸水處理后的銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)于未處理的降低了1.6%～34%。不同無性系的銀杏種仁之間也有顯著性差異(P<0.01)，新村18號(hào)、長(zhǎng)興1號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，葉籽銀杏質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表8　不同處理方法處理后不同無性系銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方差分析

表9　不同處理方法處理后不同無性系銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

3　結(jié)論與討論

當(dāng)銀杏種仁中的細(xì)胞被破壞后，細(xì)胞里的糖苷酶就會(huì)釋放出來分解氰苷，生成劇毒的氫氰酸。人和動(dòng)物體內(nèi)也含有糖苷酶，在食用了含有氰苷的食物后，人體內(nèi)的糖苷酶與生氰糖苷發(fā)生水解反應(yīng)，生成氫氰酸引起中毒[10,12-13]。本試驗(yàn)通過加入外源的糖苷酶，使銀杏種仁中的生氰糖苷水解釋放出氫氰酸。本試驗(yàn)的結(jié)果分析可知，經(jīng)過不同處理的銀杏種仁中的氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異：微波加熱、豆油翻炒后銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未處理的生銀杏種仁中高，經(jīng)沸水煮的銀杏種仁中的氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未處理的低。微波爐加熱處理后銀杏種仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，是因?yàn)樵诩訜徇^程中，細(xì)胞里的作為酶解反應(yīng)催化物的水被快速且大量消耗。同時(shí)溫度的快速上升使得酶失活，銀杏中較少的生氰糖苷被酶解為氫氰酸，但是與未處理的銀杏種仁中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。豆油翻炒法提高了銀杏中的氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的機(jī)制與微波處理類似，主要是因?yàn)樵跓嵊透邷赜绊懴?，銀杏種仁中的參與酶解反應(yīng)的糖苷酶部分失活，被酶解釋放出的氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)減少；水煮法處理后氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低是因?yàn)殂y杏種仁在水中加熱時(shí)，隨著溫度的逐漸升高，糖苷酶的活性變高，酶解了大量的生氰糖苷，生成了氫氰酸被釋放出來[16-22]。

維他命B6是許多酶促反應(yīng)的主要成分，如促進(jìn)氨基酸和神經(jīng)傳遞素的新陳代謝等。MPN抑制了維他命B6的酶促反應(yīng)中的一種谷氨酸脫氫酶GAD的活性，使酶促反應(yīng)過程不能正常完成，從而引起抽搐，嘔吐等中毒反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過不同處理后的銀杏種仁中的MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)有差異：微波加熱、豆油翻炒后銀杏種仁中MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，而經(jīng)過沸水煮后的銀杏種仁中的MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未處理的生銀杏種仁中低。維他命B6的水溶性很高，MPN作為其衍生物也具有很高的水溶性，在沸水加熱過程中，大部分已溶解在水中，銀杏種仁中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低[4]。因此，在食用時(shí)，盡量選擇沸水煮后的銀杏，降低中毒的幾率。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，市場(chǎng)上可供食用的杏仁中氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過20 μg/g，銀杏胚乳中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為9.88 μg/g，未超過該質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但胚中質(zhì)量分?jǐn)?shù)高至158.37 μg/g，胚中的氫氰酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比胚乳中質(zhì)量分?jǐn)?shù)高至11～16倍，因此在生食時(shí)需將胚去除，提高食用安全性。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于食用品中MPN的最低安全食用質(zhì)量分?jǐn)?shù)還沒有相關(guān)規(guī)定。

此外，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，不同無性系銀杏種仁中的氫氰酸和MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)也存在顯著性差異。本研究中氫氰酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是藤久郎，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是新村18號(hào)，藤久郎是新村18號(hào)的1.75倍；MPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是葉籽銀杏，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是新村18號(hào)。在銀杏果用無性系的選擇可將其作為參考之一，且在銀杏果的加工利用方面有重要意義。