劉 玲　傅 曉　柯皓天　呂 銀

(1.四川省絲綢工程技術研究中心，四川成都　610031；2.四川省絲綢科學研究院，四川成都　610031)

SSR(Simple Sequence Repeats)即簡單重復序列DNA，又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，由Moore 和Sollot terer 于1991 年提出，是以1-6 bp核苷酸為重復單位，多次串聯(lián)重復組成的DNA序列[1]。SSR具有多態(tài)性高、實驗操作簡單、共顯性等優(yōu)點，目前已應用在桑樹的遺傳多樣性分析、雜交組合親本多態(tài)性及遺傳背景等方面。本文就桑樹SSR實驗過程中的技術要點進行分析。

1　基因組DNA提取

桑樹基因組DNA提取一般采用稍加改進的CTAB法[2]從硅膠干燥過的桑葉中提取，但當桑葉中含糖量過高時，這種方法不能將多糖完全除盡。

用4×CTAB法正式提取之前，加如下兩個步驟：(1)在桑葉粉中加入1.5mL去糖buffer，震蕩混勻，冰浴10min；(2)7000rpm，4℃離心10min；(3)去上清液，加入4×CTAB提取液，進行稍加改進的CTAB法的步驟。實踐證明，去糖buffer能去除大量多糖(圖1)。

M： Marker；1-7： 直接用4×CTAB法提取的樣品；1’-7’：在正式提取前加了兩個步驟的樣品

去糖buffer配制：1M/L Tris-HCl 100 mL，0.5M/L EDTA 50mL，NaCl 7.305g，加去離子H2O定容至500mL，高壓蒸汽滅菌后即可使用。

2　引物篩選

參考桑樹SSR分析相關文獻，如RAMESH K. AGGARWAL等[3]，Weiguo Zhao等[4]，Mathithumilan Balachandran等[5]，選擇其中的100多對引物，根據(jù)序列號在Genbank上查看引物信息，確定每對引物目的產(chǎn)物的長度，并下載。下載完畢，在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上比對，選出在川?；蚪M中分布均勻的引物，引物合成以后用2-3個性狀不同的桑樹品種進行篩選。

3　PCR擴增

3.1　PCR反應體系優(yōu)化

SSR是一種基于PCR技術的分子標記，實驗結果易受反應組分的影響。由于研究方法、目的、實驗材料、引物、技術要求不同，桑樹SSR-PCR反應體系沒有固定的標準。為了確保實驗結果的準確性和重復性，在正式PCR擴增實驗前，可采用單因素設計和正交設計任意一種，或者兩種方法結合的方式，對PCR反應體系中的組分進行優(yōu)化。

單因素分析處理組數(shù)多，且不能兼顧各因素之間的相互作用；正交設計可以分析因素間的交互作用，但受到的試驗操作誤差較大而且也不能顧及個別因素的影響。實驗者應根據(jù)實際情況選擇合適的方法優(yōu)化。

3.2　引物退火選擇

引物退火溫度也是影響PCR擴增效果的一個關鍵因素。不同引物的退火溫度需要摸索。單個引物的退火溫度確定，可采用梯度PCR，設置溫度：引物Tm值±4℃，PCR儀自動生成12個溫度進行擴增。根據(jù)電泳檢測結果確定每對引物的最適退火溫度。但是這種方法比較繁瑣耗時，僅適合引物少的情況采用。

多對引物同時擴增，反應程序可采用降落PCR。降落PCR能夠避免或有效降低由退火溫度過高或過低等因素引起的非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生[6]，省去了摸索每對引物退火溫度的繁瑣步驟，節(jié)省了實驗時間。

桑樹SSR-PCR擴增，降落PCR程序可參照趙衛(wèi)國的研究[7]：95℃預變性3min；然后94℃變性30 s，63℃退火1min，設置每個循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸1min，共16個循環(huán)；94℃變性30s ，56℃退火1min，72℃延伸1min，共24個循環(huán)；最后72℃延伸5min，反應結束控制在10℃。

4　凝膠配制及電泳

SSR-PCR擴增產(chǎn)物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。凝膠濃度根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小確定，一般為5%-8%。

聚丙烯酰胺凝膠聚合是由四乙基乙二胺(TEMED)催化過硫酸銨產(chǎn)生的自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，形成三維網(wǎng)狀結構。凝膠完全聚合需要1.5-2h。

過硫酸銨最好現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的放置應不超過3d。灌完膠后，剩余的凝膠溶液一般5min后顯示聚合，如果30min后仍然沒有聚合，則說明過硫酸銨量少或者質(zhì)量不好，膠板易黏膠和漏膠。如果5min內(nèi)開始凝固，則過硫酸銨過量，會造成梳子插入困難和氣泡難以清除；過多的過硫酸銨還會導致電泳過程中DNA條帶發(fā)虛和扭曲[8]。為了消除過硫酸銨對電泳的影響，在正式電泳之前需在200-220V下預電泳10-20min。一般50mL凝膠溶液中需加入10%過硫酸銨315μL，TEMED 25μL。

電泳緩沖液為1×TBE，配制好的緩沖液連續(xù)使用最多不超過4次；電泳電壓一般為120V，電壓太高會導致凝膠發(fā)熱，使DNA條帶呈月牙狀。濃度為8%的凝膠在120V電壓下電泳1h 40min。

5　凝膠染色

凝膠染色采用銀染法(1.0g/L AgNO3)。原理如下：Ag+與DNA中帶負電的磷酸基團共價結合，在堿性環(huán)境下，由甲醛還原成黑褐色的金屬銀沉積于凝膠中而顯示出DNA帶型[9]。

染色前，要待硝酸銀完全溶解并混勻后再放入凝膠，否則銀顆粒會嵌入膠中，使背景雜亂。染色時間控制在8-10min。

6　凝膠顯色

顯色液配制：4g氫氧化鈉、0.08g無水碳酸鈉和0.8mL甲醛，去離子H2O定容至200mL。無水碳酸鈉在顯色液中提供堿性環(huán)境，促進凝膠顯色，氫氧化鈉可提高無水碳酸鈉的濃度，縮短顯色時間。

顯色時，要嚴格控制和把握顯色時間，一般最多顯色5min就要拍照。5min以內(nèi)，凝膠條帶清晰，背景淺。5min以后，隨著時間增加，凝膠背景會越來越深，以至于變黑，無法讀帶(圖2)。

M：marker；1-7：染色時間≤5min；1’-7’：染色時間≥5min

桑樹是中國重要的經(jīng)濟作物，SSR標記是研究桑樹遺傳多樣性、親緣關系和群體結構等的重要手段。本文通過分析桑樹SSR實驗技術要點，指出了需要注意的問題，并對可能出現(xiàn)的問題提出了解決辦法，以期為SSR分子標記在桑樹領域更廣泛地應用提供參考。