謝川星　趙振嫻　熊本華　諶倫富　談文輝　王茜齡　杜華茂

(1. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715，2. 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400716)

納米銀 (Silver nanoparticles, SNP)是粒徑為1-100nm的金屬銀單質(zhì)，可由物理法、化學(xué)法或生物法等多種方法制備而成[1]。納米銀對大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體乙肝病毒、流感病毒等數(shù)百種致病微生物都有強烈的抑制和殺滅作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性[2-3]。近30年來含納米銀的織物、日用品、衛(wèi)生用品、工業(yè)用品及醫(yī)療器械等發(fā)展異常迅猛，全球全年納米銀年產(chǎn)量約220-320t,產(chǎn)值達0.79-2.54億美元[4]。隨著納米銀的大量生產(chǎn)與廣泛應(yīng)用，排放到環(huán)境中的納米銀也與日巨增，如果在土壤和自然水體中富積，對環(huán)境微生物及植物可能產(chǎn)生毒副作用。Qin(2010)報道水蚤暴露在含納米銀的水體中24h與48h的半數(shù)致死劑量分別為3.56μg/L,1.75μg/L，0.5μg/L即可影響水蚤的繁殖[5]。納米銀進入土壤后會對土壤微生物產(chǎn)生影響，改變微生物的多樣性與分布特點，原因在于不同微生物對納米銀的耐受性不一致，比如氨基氧化性古細菌比細菌更敏感；而細菌中，酸桿菌門和疣微菌門比其它細菌更敏感[6]。土壤中納米銀對植物的結(jié)構(gòu)、生理生化特性、生物量也會產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)。Barrena 等研究發(fā)現(xiàn)100mg/L 納米銀(粒徑 29nm)處理可抑制黃瓜和生菜的種子萌發(fā)[5]。Stampoulis 等研究發(fā)現(xiàn)，納米銀濃度為 100mg/L、500mg/L 時，西葫蘆生物量和蒸騰作用較空白組分別下降 41%和57%[7]。Dimkpa 等研究發(fā)現(xiàn)，納米銀(粒徑 10 nm)顯著降低小麥芽和根的長度，且降低程度與加入納米銀的濃度有關(guān)[3]。黑麥草種子暴露于 40mg/L 濃度的納米銀溶液中，其根系很難生長根毛，根尖細胞高度液泡化，且觀察到表皮有破碎的細胞。以往的研究表明，納米銀的環(huán)境毒性與植物毒性是濃度依賴性的。

近年有研究報道利用納米銀預(yù)防家蠶的細菌性、病毒性傳染病，取得較好的實驗數(shù)據(jù)[7-9]。如果該法可行，納米銀將通過蠶沙進入自然環(huán)境，特別是桑園。因此，本研究利用盆栽試驗，在土壤中按20mg/Kg, 40mg/Kg (土壤干重)添加納米銀，初步分析納米銀對土壤微生物及移栽桑苗生長的影響。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

桑樹:嘉陵30號組培苗，2017年10月移栽入土。

納米銀購于重慶新位點生物科技有限公司，粒徑20-40nm占80%。

丙酮、硝酸、高氯酸、愈創(chuàng)木酚、硝酸鉀、異丙醇、對氨基苯磺磷酸、α-萘胺(購于薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)、三氯乙酸、過氧化氫等藥品購于重慶化學(xué)試劑廠。

1.2　實驗設(shè)計及分組

根據(jù)文獻報道土壤中納米銀含20mg/Kg對黑麥草[5]作物有促進生長作用，濃度大于20mg/Kg則表現(xiàn)出毒性，因此本實驗設(shè)20mg/Kg 、40mg/Kg兩個濃度分析納米銀對桑樹生長的影響。土壤經(jīng)高壓滅菌后干燥稱重，加入納米銀并混勻,加自來水至合適的濕度，2018年1月19日栽種4月齡的桑樹組苗，每組4株，放于28℃溫室，每天光照10h，定期澆水，2018年3月中旬轉(zhuǎn)至室外。觀察桑樹的生長，4個月后測定桑葉葉片中葉綠素含量、過氧化氫酶(CAT)，POD、硝酸還原酶等的酶活性；桑葉葉片，桑樹木質(zhì)部、韌皮部及根部納米銀含量；以及土壤中可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌的數(shù)量。

1.3　土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定

采用稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法。細菌于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基(加兩滴0.5%重鉻酸鉀)，真菌于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(加34mg/mL氯霉素)

10g土壤樣品倒入裝有90mL無菌水的250mL的三角瓶中(裝有玻璃珠)，置于搖床上(120r/min，常溫)，振蕩20min，使土壤充分分散成為土壤懸液。用滅菌生理鹽水作用10倍系列稀釋度。各稀釋度取0.1mL分別涂布三種培養(yǎng)基，每種三個重復(fù)。細菌于37℃培養(yǎng)1-3d；真菌于25℃培養(yǎng)3-5d；放線菌于28℃培養(yǎng)4-7d。選取菌落數(shù)在10-300之間的平板計數(shù)。土壤中菌落數(shù)按公式計算。

菌落數(shù)/g土壤(CFU·g-1) = 計數(shù)皿平均菌落數(shù) ×稀釋倍數(shù)/10。

1.4　納米銀的含量測定

分別取桑葉葉片、桑樹木質(zhì)部、韌皮部及根部，烘干粉碎。稱取0.5g烘干的樣品置于消化管中，加5mL 65%硝酸，于室溫硝化過夜。將樣品轉(zhuǎn)至燒杯中，加入2mL 30%過氧化氫，在通風廚中于加熱板上消解至接近干，用2%的硝酸定容至5mL。

配制納米銀標準溶液，濃度為：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL、1μg/mL,用火焰原子吸收分光光度計(ZA3300)測定標準品及各樣品的吸光度，繪制標準曲線，并換算出各樣品納米銀含量。

1.5　酶活性測定

1.5.1酶液的提取

稱取剪碎混勻的桑葉葉片0.3g置與預(yù)冷的研缽中，加入適量預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液(共6mL，分兩次加入)和少量石英砂冰浴研磨成勻漿后，于離心管中，在4℃、15000g下離心15min，上清液即為酶粗提液。

1.5.2POD酶活性的測定

按G.QIN等[5]采用愈創(chuàng)木酚法進行。主要步驟為各取上清液80μL，分別加入3mL反應(yīng)液(300mL的0.05mol/L磷酸緩沖液，168μL愈創(chuàng)木酚，1.704mLH2O2pH7.0)，測定3min內(nèi)470nm吸光值，按 下列公式計算酶活性。

POD活性(U·g-1·min-1·FW) =ΔD470×VT/(W×VS×0.01×t)

其中，ΔD470 —反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，以，W—植物鮮重，g；Vs—測定時所用酶液體積，mL；VT—提取酶液總體積，mL；t—反應(yīng)時間，min。

1.5.3過氧化氫酶活性的測定

各組取2mL酶粗提液于沸水浴2min以滅活過氧化氫酶，作為對照。取0.1mL酶粗提液，加1mL Tris-HCl，1.7mL去離子水，于25℃水浴中預(yù)熱3min,再加入0.2 mL 0.2mol/L H2O2溶液，混勻后立即測定A240值，每隔30s讀數(shù)一次，持續(xù)測定3min。每個樣品做3個重復(fù)。以1min內(nèi)A240降低0.1的酶量為1個酶活單位(U)。按下列公式計算酶活。

CAT活性(U·g-1·min-1·FW) =(A240 control-A240 test)×V1/(W×V2×0.1×T)

V1：提取酶液的總體積，單位為mL；W：植物鮮重(g)；V2：測定時所用酶液體積(ml)； T：反應(yīng)時間(min)。

1.5.4硝酸還原酶活性的測定

分別取各組葉片，用蒸餾水洗凈、濾紙吸干、剪碎。稱取0.3g放入試管。加入9mL反應(yīng)液(稱3.03g KNO3溶于300mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液中，再加3mL異丙醇)。各組設(shè)一對照，加1mL三氯乙酸使酶失活。

將所有試管放入真空干燥器中、避光，反復(fù)抽氣直至葉片沉至管底，將各試管于30℃避光保溫30min。加1mL三氯乙酸，搖勻終止酶反應(yīng)。靜止2min，吸取上清液2mL加入另一試管，加 4mL 1%磺胺和 0.2%a-萘胺，60℃水浴保溫20min，測定A540值。

按公式計算活活性：硝酸還原酶活性(U)=C×V1/(V2×W×T)

C：反應(yīng)液催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量(μg)，V1：提取酶液時加入的緩沖液體積(mL)，V2：酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積(mL)，W：樣品質(zhì)量(g)，T：反應(yīng)時間(h)。

1.6　葉綠素含量的測定

稱取新鮮葉片0.1g，剪成細絲狀置于盛有10mL 80%丙酮的試管中，封口并用錫箔紙包裹試管。置于黑暗條件下至組織完全變白(大概要一周左右)。分別測定A663、A645、A652，按方式計算葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)的量，葉綠素總量(CT)= Chla+Chlb。

Chla=12.72A663-2.59A645；Chlb=22.88A645-4.67A663

1.7　統(tǒng)計分析

本試驗中三個組土壤中微生物含量、桑樹不同組織納米銀含量、桑葉的過氧化氫酶、過氧化物酶、硝酸還原酶的活性、葉綠素含量以及均表示為平均數(shù)±標準差，采用軟件SPSS19.0選用LSD進行多重比較，P<0.05,P<0.01分別表示差異顯著、差異極顯著。

2　結(jié)果

2.1　納米銀對桑樹生長的影響

在溫室中1個月后，低濃度納米銀組(20mg/kg土壤)桑樹開始發(fā)芽，隨后是對照組，高濃度納米銀組(40mg/kg土壤)桑樹發(fā)芽最晚。轉(zhuǎn)至室外生長后，對照組桑樹的長勢逐漸超過低濃度組，到第4個月，可見納米銀組桑樹葉片薄、質(zhì)軟，逐漸枯黃(見圖1)。最終，添加納米銀的實驗組的株高、基徑、葉片數(shù)和總?cè)~面積都比對照組差，但因桑樹苗株高不一致，未對這些參數(shù)進行統(tǒng)計分析。40mg/kg組桑樹長勢最差，移栽后5個月出現(xiàn)枯萎死亡。

圖1　納米銀對桑樹生長的影響

2.2　納米銀對土壤微生物菌群的影響

我們分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(含氯霉素)、高氏一號培養(yǎng)基(含重鉻酸鉀)培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌。計數(shù)結(jié)果顯示，納米銀對放線菌影響最大，每克土壤放線菌數(shù)量從32萬下降至13萬和9萬，分別減少了57%和72%。其次是細菌，每克土壤總細菌量從4.15萬下降至1.30萬和1.50萬，分別減少了69%和63%。每克土壤真菌從1.20萬下降至0.85萬和0.51萬，分別減少了30%和58%(見圖2)。從結(jié)果可以看出土壤中納米銀濃度超過20mg/Kg對微生物的多樣性在一定的破壞作用。

2.3　桑樹中納米銀的分布

本研究中兩實驗組人工添加納米銀至20mg SNP/kg土壤，40mg SNP/kg土壤，因長時間在室外放置，約一半納米銀隨雨水流失，最后測定對照組含量為1.467mg/kg，8.289mg/kg，17.614mg/kg。對桑樹根、木質(zhì)部、韌皮部和葉片的銀含量測定結(jié)果顯示：20mg SNP/kg土壤組比對照組略高，但無顯著性差異，且葉片中均未檢出。除木質(zhì)部外，20mg SNP/kg土壤組顯著高于對照組，葉片中納米銀含量為0.8μg/g，根和韌皮部均達到1.3μg/g (圖3)。

圖2　納米銀對土壤微生物的影響

圖3　納米銀在桑樹不同組織中的分布

2.4　納米銀對桑葉葉片中酶活性及葉綠素含量的影響

將組培桑樹苗移栽4個月后取桑葉進行過氧化氫(POD)，過氧化物酶(CAT)和硝酸還原酶的活性測定，結(jié)果表明土壤中的納米銀導(dǎo)致桑葉抗氧化酶的活性上升，兩個實驗組的POD分別是對照組的2.1倍、3.4倍， CAT是對照組的1.7倍、2倍；但是，硝酸還原酶活性下降5.0-8.7倍，土壤納米銀濃度越高，桑葉中酶活變化越大(見表1)。說明納米銀一方面刺激桑樹產(chǎn)生了活性氧，桑樹應(yīng)激性上調(diào)兩種抗氧化酶的表達以維持植株內(nèi)的氧化還原電勢平衡。硝酸還原酶是植物氮素同化過程的限速酶，該酶活下降說明土壤中納米銀超過20mg/kg抑制氮的生物利用。

表1　桑葉移栽4月后桑葉的酶活性與葉綠素含量測定結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)的肩標為不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著，相同字母或沒有字母表示差異不顯著。

與對照組相比，土壤納米銀對桑樹葉綠素含量影響不顯著，濃度為20mg/kg 時，葉綠素a、葉綠素b、稍有下降，但在40mg/kg濃度下總?cè)~綠素含量略有上升。

3　討論

土壤中銀含量水平極低，全球平均值僅為0.01-0.50mg/kg。從已有的資料，中國土壤中銀的平均水平達0.35mg/kg。由于工業(yè)行為，部分地區(qū)土壤中銀含量超過背景值3-50倍[10]。在本實驗中采用的土壤中銀含量達1.46mg/kg。納米銀作為近三十年興起的新型抗菌材料，由于其出色的抗多種致病微生物能力，全球每年有約2.54億美元的產(chǎn)值[6]。因此，從生產(chǎn)環(huán)節(jié)或消費終端釋放到環(huán)境中的納米銀引起了廣泛關(guān)注。進入土壤的納米銀一部分隨雨水流失，一部份轉(zhuǎn)入深層土壤，在厭氧條件下轉(zhuǎn)化為納米AgS，而表層的納米銀較為穩(wěn)定。本實驗進行的4個月期間，土壤中人工添加的納米銀減少了一半。從平板分離的三類微生物來看，20mg/kg納米銀對土壤微生物影響較大，數(shù)量顯著減少，放線菌最敏感，其次是細菌，40mg/kg納米銀影響更大。McGee等報道在10mg/kg條件下酸桿菌(Acidobacteia)下降了6%(在菌群的初始占比為15.4%)，在50mg/kg濃度土壤中下降10%。某些菌的比例會上升，比如地發(fā)菌屬(Geothrix)增加了5%(初始占比為0.5%)。土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的改變可能會影響土壤中脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶的活性，進而影響物質(zhì)轉(zhuǎn)化和營養(yǎng)循環(huán)。

納米銀在桑樹不同組織的分布呈現(xiàn)差異，根>葉>莖，并隨土壤中濃度的增大而升高，這與盧揚等測定外源銀離子在水稻中的分布趨勢相同。桑樹被認為具有良好的修復(fù)土壤重金屬污染的能力。徐寧等報道，在贛州某地，隔、鉛、銅、鋅、砷超標2-8倍的作物很生長，但桑樹不受影響，這些重金屬能在根、莖中富集以修復(fù)土壤。在實驗條件下，土壤鎘含超過140mg/kg、鉛含量超過200mg/kg、坤含量超過160mg/kg時桑樹生長受阻，1-2年后死亡，重金屬在根與莖中大量富集。在本研究中，土壤納米銀濃度超過40mg/kg就表現(xiàn)出明顯的抑制作用，3-4個月桑樹發(fā)育受阻并出現(xiàn)植株死亡，這可能與桑樹的株齡有關(guān)，本實驗采用4月齡的組培苗，抗性較弱。因此，今后可以對不同株齡的抗性差異展開研究，以便于在治理重金屬污染的實踐中推廣應(yīng)用。

納米銀抗菌作用及動物細胞毒性作用的機理研究顯示，納米銀刺激產(chǎn)生大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，ROS具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能，能破壞生物膜的完整性，損傷蛋白質(zhì)、脂類及核酸，導(dǎo)致細胞凋亡[11]。生物已進化出不同的抗氧化機制，比如，所有生物都有硫氧還蛋白，以維持內(nèi)環(huán)境的氧化-還原平衡[12]。本研究測得納米銀組桑葉中過氧化氫酶、過氧化物酶的活性顯著高于對照組，就是因為納米銀所致；雖然20mg/Kg組桑葉與對照組一樣沒有測出納米銀，但在根與韌皮部納米銀含量高于對照組，所以葉片中兩種抗氧化酶活性增高。40mg/Kg組桑樹出現(xiàn)枯萎死亡，我們推測細胞內(nèi)抗氧化能力不足以消除ROS，導(dǎo)致細胞死亡。