谷俐媛　陶俊宇　吳苑瀅　宋漫玲　胡庭俊

摘要：目的 觀察辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分對內(nèi)毒素血癥小鼠生化指標和炎性細胞的影響，探討其作用機制。方法 采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取辣蓼全草中總黃酮，結合大孔樹脂純化富集獲得辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分，脂多糖（LPS）刺激小鼠建立內(nèi)毒素血癥模型。實驗小鼠分為空白組、模型組和FEA高、中、低劑量組，各給藥組給予相應濃度藥液。測定腸組織丙二醛（MDA）和髓過氧化物酶（MPO）的含量，肝組織總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，血清還原型谷胱甘肽（GSH）含量與溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）的活性，RT-PCR檢測肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素（IFN）-α、IFN-γ和白細胞介素-2（IL-2）含量。結果 與空白組比較，模型組小鼠腸組織MDA、MPO和血清ACP水平升高，肝組織T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平降低，血清、腸組織和肝組織TNF-α升高，肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達升高；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠腸組織MDA、MPO和血清ACP水平降低，F(xiàn)EA中、高劑量組肝組織T-AOC、T-SOD、GSH-Px和血清GSH、LZM水平升高，F(xiàn)EA各劑量組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α含量顯著降低，肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達顯著降低；FEA高劑量組較模型組小鼠肺組織、回腸和結腸病理形態(tài)明顯改善。結論 FEA部分能降低LPS誘導小鼠內(nèi)毒素血癥的炎性損傷，對機體具有保護作用。

關鍵詞：辣蓼；黃酮乙酸乙酯；內(nèi)毒素血癥；生化指標；炎性細胞；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.009

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0040-06

Abstract： Objective To observe the effect of flavonoids ethyl acetate （FEA） from Polygonum hydropiper L. on biochemical indexes and inflammatory cytokines in mice with endotoxemia； To expore the mechanism. Methods Total flavonoids in the whole plant of Polygonum hydropiperum L. were extracted by enzymolysis-ultrasonic coupling method. The FEA part were obtained by extracting and separating， followed with macroporous resin purification and enrichment. The animal model of endotoxemia was established by stimulation of lipopolysaccharide （LPS） in mice. Experimental mice were divided into blank group， model group， FEA high-， medium-， and low-dose groups. Each administration group was given the corresponding concentration of herb liquor. The concentration of malondialdehyde （MDA） and myeloperoxidase （MPO） in intestinal tissue， total antioxidant capacity （T-AOC）， superoxide dismutase （T-SOD） activity and glutathione peroxidase （GSH-Px） activity in liver tissue， glutathione （GSH）， lysozyme （LZM） and acid phosphatase （ACP） in serum were determined. The contents of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interferon （IFN）-α， IFN-γ and interleukin-2 （IL-2） in lung tissue were detected by RT-PCR. Results Compared with blank group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP of model mice were increased， while T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM levels were decreased； TNF-α in serum， intestinal and liver tissues were increased， the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissue were increased. Compared with the model group， the levels of MDA， MPO in intestinal tissue and serum ACP were decreased in all dose of FEA groups； The levels of T-AOC， T-SOD， GSH-Px in liver tissue， serum GSH and LZM of FEA medium and high-dose groups were increased. The content of TNF-α in mice serum， intestinal and liver tissues of all dose of FEA groups were significantly reduced， and the expressions of TNF-α， IFN-α， IFN-γ and IL-2 mRNA in lung tissues were significantly decreased. The pathological morphology of mice lung， ileum and colon tissues of FEA high-dose group were significantly ameliorated than model group. Conclusion FEA can attenuate inflammation injury of endotoxemia mice induced by LPS， which has protective effects for organism.

Keywords： Polygonum hydropiperum L.； FEA； endotoxemia； biochemical index； inflammatory cell； mice

辣蓼是蓼科蓼屬一年生草本植物，被廣泛用于慢性鼻炎、皮脂腺囊腫的治療，其抗氧化成分主要為黃酮苷類成分異槲皮苷和黃酮苷元類成分槲皮素[1]。內(nèi)毒素血癥由革蘭陰性菌感染引起，以敗血性休克為標志，常伴發(fā)腦、心、腎、肝臟等重要器官的衰竭[2]。革蘭陰性菌感染時脂多糖（LPS）的釋放會引起腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素（IL）-1β等初級炎癥因子的釋放。有研究表明，在內(nèi)毒素血癥早期抑制此類因子能有效緩解炎癥[3]。黃酮類藥物憑借其顯著的抗炎與抗氧化功效、低毒易得的特點，近年來引起廣泛的關注與應用[4]。但關于辣蓼總黃酮對內(nèi)毒素血癥保護效果的研究尚未見報道。

本研究采用酶解-超聲偶聯(lián)法提取辣蓼全草中的總黃酮，經(jīng)萃取分離雜質(zhì)，結合大孔樹脂純化富集獲得辣蓼黃酮乙酸乙酯（FEA）部分。前期研究表明，小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）受到LPS刺激12 h內(nèi)活性氧（ROS）與一氧化氮（NO）的釋放急劇增多，但經(jīng)FEA處理后1 h能明顯減少LPS誘導的ROS釋放量；在FEA預處理1 h后能減少LPS刺激所誘導的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的釋放，有助于降低炎癥損傷；此外，F(xiàn)EA預處理1 h后能增加抗炎因子IL-10的生成[5]。為了進一步考察FEA的體內(nèi)抗炎效果，本實驗采用LPS刺激小鼠建立內(nèi)毒素血癥小鼠模型，觀察FEA部分對LPS誘導內(nèi)毒素血癥小鼠生化指標和炎性細胞的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性昆明種小鼠80只，5～6周齡，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（桂）2014-0002。飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、濕度50%～80%環(huán)境，自由攝食飲水。

1.2 藥物

FEA部分，廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室提取。

1.3 主要試劑與儀器

LPS（大腸桿菌055：B5，批號011M4001V），胰酶（批號031M7358V），SIGMA；還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、髓過氧化物酶（MPO）、總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；超純RNA提取試劑盒，康為世紀公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR染料，TAKARA公司；EnSpire多功能熒光酶標儀，PerkinElmer公司；實時定量PCR儀（BIO-RAD公司，型號CFX 96），純水系統(tǒng)（MERCK MILLIPORE公司，型號Direct-Q 5UV），ZT-12M生物組織自動脫水機、YB-6LF型生物組織石蠟包埋機、YT-7FB生物組織攤烤片機，孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司；輪轉式切片機（型號RM2245），徠卡纖維系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；微量離心機（型號5418），Eppendorf公司；制冰機，SANYO公司。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

適應性飼養(yǎng)3 d，80只小鼠隨機分為空白組、模型組和FEA高、中、低劑量組，每組16只。FEA高、中、低劑量組分別按200、100、50 mg/kg劑量灌胃FEA部分溶液0.2 mL，模型組灌胃LPS（17 mg/kg）溶液0.2 mL，空白組灌胃雙蒸水10 mL/kg，每日1次，連續(xù)3 d，最后1次給藥1 h后，空白組腹腔注射0.9%氯化鈉10 mL/kg，其余各組腹腔注射LPS溶液（17 mg/kg）0.2 mL，24 h后眼球采血并處死，分離受試小鼠肺、小腸、肝組織待測。

2.2 生化指標和炎癥因子測定

取小鼠小腸組織，用冰生理鹽水制備10%回腸組織勻漿液，嚴格按照試劑盒說明書測定腸組織勻漿MDA含量和MPO活性，并用考馬斯亮藍試劑盒測定其總蛋白含量。取肝組織勻漿上清液，嚴格按照試劑盒說明書測定肝臟組織勻漿T-AOC、T-SOD、GSH-Px的活性，并用考馬斯亮藍試劑盒測定其總蛋白含量。

取小鼠血清，嚴格按照試劑盒步驟測定血清GSH含量及LZM、ACP活性。ELISA試劑盒測定血清、腸組織勻漿及肝組織勻漿TNF-α含量。

2.3 組織病理學觀察

取小鼠右肺及回腸、結腸各1～2 cm，福爾馬林固定，其余腸組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?%甲醛溶液固定，石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察腸組織病理學變化。

2.4 RT-PCR檢測肺組織腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細胞介素-2基因表達

取分離所得的肺組織，按試劑盒說明書提取RNA進行反轉錄，對目的基因與內(nèi)參基因分別用實時定量PCR儀和熒光定量PCR儀進行PCR擴增，反應體系嚴格按PCR儀說明書進行操作。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析，多重比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 一般狀況

小鼠注射LPS后8 h，扎堆蜷縮，攝食量減少或停止，12 h后各給藥組和模型組出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象且模型小鼠開始出現(xiàn)死亡。結果見表2。

4.2 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠腸組織丙二醛含量和髓過氧化物酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠腸組織勻漿MDA含量、MPO活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠腸組織勻漿MDA含量顯著降低，F(xiàn)EA各劑量組腸組織勻漿MPO活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果見表3。

4.3 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠肝組織總抗氧化能力、總超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織勻漿T-AOC水平降低但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），T-SOD、GSH-Px水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠肝組織勻漿T-AOC水平顯著升高，F(xiàn)EA各劑量組小鼠肝組織勻漿T-SOD、GSH-Px水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表4。

4.4 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠血清還原型谷胱甘肽、溶菌酶和酸性磷酸酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清GSH、LZM活性降低但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），ACP活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA中、高劑量組小鼠血清GSH、LZM活性顯著升高，ACP活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表5。

4.5 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠血清、腸組織和肝組織腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠血清、腸組織和肝組織TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見圖1。

4.6 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α、干擾素-α、干擾素-γ和白細胞介素-2基因表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，F(xiàn)EA各劑量組小鼠肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ和IL-2 mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結果見圖2。

4.7 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

模型組較空白組小鼠肺泡壁明顯增厚，F(xiàn)EA各劑量組較模型組小鼠肺泡壁增厚現(xiàn)象減輕，F(xiàn)EA高劑量組效果最好。模型組較空白組小鼠肺組織有大量中性粒細胞浸潤，并有大面積滲出液漏出，肺毛細血管充血、出血，F(xiàn)EA高劑量組較模型組小鼠肺組織滲出液漏出現(xiàn)象減輕，中性粒細胞未減少。結果見圖3。

4.8 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠回腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠回腸組織結構完整，可見完整的絨毛；模型組小鼠回腸組織結構出現(xiàn)很大程度的破壞，黏膜下層變薄，存在絨毛大量脫落的現(xiàn)象；FEA高劑量組小鼠回腸組織結構完整，與空白組比較無明顯差異。結果見圖4。

4.9 辣蓼黃酮乙酸乙酯部分對模型小鼠結腸組織病理形態(tài)的影響

空白組小鼠結腸組織結構完整，可見完整的絨毛；模型組小鼠結腸組織結構出現(xiàn)很大程度的破壞，黏膜下層變薄，存在絨毛大量脫落的現(xiàn)象；FEA高劑量組小鼠結腸組織結構完整，可見完整的絨毛，與空白組比較無明顯差異。結果見圖5。

5 討論

黃酮具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化性等作用。有研究表明，腹腔注射槲皮素與黃豆苷元能顯著降低血中TNF-α水平，從而降低LPS誘導的敗血癥肺損傷[6-7]。本實驗結果顯示，F(xiàn)EA通過提升小鼠體內(nèi)肝臟抗氧化防御酶促體系的活性可降低LPS對小鼠機體的損傷；抑制LPS誘導的小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的產(chǎn)生，降低肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表達，減輕LPS對小鼠組織的損傷尤其是肺組織的損傷。

本實驗用FEA預處理3 d，能降低LPS對小鼠回腸與結腸的結構損傷，降低LPS刺激下腸道MDA的生成，從而降低氧化應激損傷。腸組織MPO在腸組織局部含量的升高可反映中性粒細胞浸潤的程度。FEA預處理后MPO含量的降低表明腸道中性粒細胞浸潤現(xiàn)象減少。SOD是清除氧自由基的重要酶系，對細胞損傷具有保護作用，可阻止氧化自由基鏈式反應擴大，是生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的重要防線。FEA預處理能顯著提升小鼠肝臟T-SOD水平，提高小鼠肝臟總T-AOC，對抗LPS誘導的氧化應激。有研究表明，給予抗氧化劑或提升機體抗氧化力有助于降低敗血癥損傷，在LPS誘導的豬與大鼠敗血癥模型中，N-乙酰半胱氨酸的抗氧化與降低敗血癥損傷功效已被證實，提示在敗血癥病程中降低氧化損傷有助于提高動物存活率[8-9]。GSH不僅能消除機體自由基還可以提高機體免疫力，作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，保護許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。有研究顯示，運用還原型谷胱甘肽治療輪狀病毒腸炎合并肝功能異常30例，結果表明療效可靠，提示GSH能一定程度上緩解腸炎[10]。在本實驗中，F(xiàn)EA預處理3 d，一方面提升肝組織GSH-Px活性，另一方面提升血清GSH含量，為清除機體內(nèi)各處自由基提供物質(zhì)基礎。類似研究也表明，阿魏酸對LPS誘導的大鼠敗血癥模型可升高GSH-Px、GSH與SOD水平，并降低MDA水平及DNA的損傷[11]。總之，F(xiàn)EA通過提升小鼠體內(nèi)肝臟的抗氧化防御酶促體系的活性從而降低LPS對小鼠機體帶來的損傷。

溶酶體是重要的細胞器，內(nèi)含多種水解酶如ACP，參與細胞的消化、防御等重要生理過程。模型組小鼠受到LPS刺激，導致ACP過多釋放，細胞產(chǎn)生自溶、組織發(fā)生變性，而FEA能通過提升機體的抗炎、抗氧化能力，從而降低機體的炎癥損傷，這在本實驗肺組織、腸組織HE病理觀察結果均有體現(xiàn)。

本實驗結果表明，模型組腸組織、血清和肝組織TNF-α均顯著增加。這種現(xiàn)象一方面利于TNF-α誘導內(nèi)皮細胞和巨噬細胞釋放IL-1β，刺激其他細胞因子的生物合成，形成逐級放大的瀑布樣連鎖反應，誘導大范圍的組織細胞損害；另一方面，這些炎癥因子特別是IL-2不僅能促進NK細胞的增殖，還能促使NK細胞產(chǎn)生TNF-α，這就導致機體源源不斷的生成TNF-α，發(fā)生惡性循環(huán)，對肺組織產(chǎn)生較強的毒性作用。FEA預處理3 d能有效降低腸組織、血清和肝組織TNF-α的含量，而肺組織TNF-α、IFN-α、IFN-γ及IL-2 mRNA的表達量也能得到顯著抑制。

綜上，F(xiàn)EA部分能降低LPS誘導的小鼠內(nèi)毒素血癥的炎性損傷，對機體有一定的保護作用，其具體機制還需進一步研究。

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（收稿日期：2017-07-25）

（修回日期：2017-09-17；編輯：華強）