王亞洲，詹　峰

(蘇州大學(xué)附屬常州腫瘤醫(yī)院，江蘇常州 213000)

近年來，大腸埃希菌的分離率在住院患者感染的病原體中一直占首位，其中50%以上的大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌株使得大腸埃希菌對(duì)藥物的耐藥率明顯提高[1-5]。在自然環(huán)境中，約80%微生物以生物膜狀態(tài)存在[6]。生物膜是微生物黏附于物體表面或組織，包含在自身分泌的保護(hù)性細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的高度結(jié)構(gòu)化的微生物群體，生物膜的結(jié)構(gòu)可保護(hù)膜內(nèi)的細(xì)菌抵抗各種環(huán)境壓力，使細(xì)菌長(zhǎng)期存活[7]。在醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生過程中，65%與生物膜有關(guān)[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究了大腸埃希菌ATCC25922在塑料、玻璃及不銹鋼表面形成生物膜的能力，并比較了ATCC25922與本院分離于無菌體液的9株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌生物膜形成能力的差別，也對(duì)醫(yī)院常用消毒劑對(duì)大腸埃希菌ATCC25922生物膜的滅菌功效進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，9株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌分離自2015年10月至2016年2月無菌體液標(biāo)本，編號(hào)分別為25、26、30、38、45、54、58、59、68，-70 ℃保存于15%甘油肉湯。

1.2試劑與儀器結(jié)晶紫染液(貝索公司)，消毒劑中和劑(溫州康泰)，過氧乙酸(上海哈勃)，戊二醛(江西匯康)，次氯酸鈉(江蘇愛物福)，乙醇(江西匯康)，碘伏(江西匯康)。BEPⅢ酶標(biāo)儀(德國(guó)西門子)，96孔培養(yǎng)板(浙江拱東)。購(gòu)買厚度為0.5 mm的塑料片、普通不銹鋼片及玻璃片，用剪刀和玻璃刀切割制成4.0 mm×20.0 mm×0.5 mm的塑料片、玻璃片及普通不銹鋼片，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)75%乙醇浸泡10 min。

1.3方法

1.3.1生物膜形成檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]所述方法，將分離的實(shí)驗(yàn)菌調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?，然后用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液稀釋為106CFU/mL。實(shí)驗(yàn)根據(jù)材料分為塑料組、玻璃組和不銹鋼組。將塑料片、玻璃片及不銹鋼片置于試管內(nèi)，分別吸2 mL上述菌液于試管內(nèi)，35 ℃培養(yǎng)24 h，將塑料片、玻璃片及不銹鋼片分別移至無菌試管內(nèi)，生理鹽水洗去游離的細(xì)菌，甲醇固定15 min，待干后加結(jié)晶紫染液染色10 min，洗去未結(jié)合的染液，待干后加入95%乙醇2 mL脫色10 min，吸100 μL到96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)吸光度(A)值，比較各組吸光度的變化。不加菌液孔作為陰性對(duì)照，測(cè)定孔吸光度大于陰性對(duì)照孔吸光度為生物膜陽性[11]。

1.3.2消毒劑對(duì)生物膜的滅菌效果依上述方法將形成生物膜的塑料片、玻璃片及不銹鋼片分別轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，分別加入75%乙醇、有效氯500 mg/L消毒液、5%碘伏、0.2%過氧乙酸、2%新潔爾滅各2 mL，以不加消毒液管為對(duì)照管,各作用1、5、15、30、60 min后吸去消毒液，加入含有相應(yīng)中和劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯2 mL，35 ℃培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)24 h觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2　結(jié)　　果

2.1大腸埃希菌不同材料表面形成生物膜能力ATCC25922大腸埃希菌在塑料、玻璃及不銹鋼的表面均可形成生物膜，在不銹鋼表面形成生物膜的能力均強(qiáng)于塑料表面和玻璃表面(P<0.05)，見表1。

2.2產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在不同材料表面形成生物膜能力本研究的9株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在塑料、玻璃及不銹鋼表面均可形成生物膜，與ATCC25922差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各菌株在不銹鋼表面形成生物膜的能力均強(qiáng)于塑料表面和玻璃表面,見表2。

表1　　ATCC25922大腸埃希菌在不同材料表面生物膜的形成能力(A值，

注：與塑料組相比，*P<0.05

表2　　產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在不同材料表面形成生物膜的能力(A值，

注:與不銹鋼組相比，*P<0.05

2.3不同消毒劑對(duì)生物膜細(xì)菌的滅菌功效使用乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、碘伏(5%)、過氧乙酸(0.2%)、新潔爾滅(2%)對(duì)不同材料表面生物膜分別作用1、5、15、30、60 min，發(fā)現(xiàn)乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、過氧乙酸(0.2%)、新潔爾滅(2%)均可在1 min殺滅生物膜細(xì)菌；碘伏(5%)作用生物膜細(xì)菌1 min，仍有細(xì)菌存活，需要5 min方可殺滅生物膜細(xì)菌。

3　討　　論

塑料、玻璃及不銹鋼材料普遍存在于醫(yī)院各種環(huán)境表面，細(xì)菌在醫(yī)院環(huán)境中的各種物體表面形成生物膜，是住院患者潛在的感染源之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌株ATCC25922及從臨床分離的9株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株均可在塑料、玻璃及不銹鋼材料表面形成生物膜，且ATCC25922與產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌無明顯差異。大腸埃希菌在不銹鋼材料表面形成生物膜的能力最強(qiáng)，玻璃材料次之。CREMET等[10]也發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在不銹鋼材料上比聚乙烯材料更易形成生物膜，此現(xiàn)象與不銹鋼表面光滑程度不如玻璃和塑料有關(guān)。盡管有研究報(bào)道生物膜內(nèi)細(xì)菌的抵抗力比游離菌顯著增高，但在本實(shí)驗(yàn)中，乙醇(75%)、有效氯(500 mg/L)、過氧乙酸(0.2%)、新潔爾滅(2%)可以在1 min殺滅生物膜內(nèi)細(xì)菌，碘伏也可在5 min殺滅生物膜內(nèi)細(xì)菌。因此，采用適宜的消毒劑和正確的消毒時(shí)間對(duì)環(huán)境表面消毒，便可降低感染的危險(xiǎn)因素，預(yù)防、控制醫(yī)院感染的發(fā)生。