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        水飛薊的毒理學(xué)安全性評價

        2018-07-12 07:27:28石麗麗趙金鵬
        中國食物與營養(yǎng) 2018年6期
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量實驗

        韓 超,石麗麗,趙金鵬,李 巖

        (中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所,北京 100050)

        水飛薊是菊科水飛薊屬的藥用植物,具有清熱解毒、疏肝利膽的傳統(tǒng)功效[1]。水飛薊的干燥果實經(jīng)提取、精制而得到的有效成分稱為水飛薊素。在歐美國家,水飛薊素作為較為經(jīng)典的保肝藥物,被廣泛應(yīng)用于各種肝損傷的治療。1972年,水飛薊引入我國作為一種保肝藥用植物推廣種植[2]。近年來,水飛薊逐漸應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域,主要用于保護肝功能。目前國內(nèi)外對于水飛薊的研究主要集中于其功效方面,關(guān)于水飛薊的食用安全性評價報道較少。本實驗通過急性經(jīng)口毒性實驗、三項遺傳毒性實驗、大鼠30d喂養(yǎng)實驗對水飛薊的毒性做了初步研究,為水飛薊在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1實驗材料

        受試物:水飛薊膠囊的內(nèi)容物為棕黃色粉末,人體推薦量為972mg/d,即每天16.2mg/kg·BW(成人按60kg體重計)。

        1.2實驗動物和飼料條件

        SD大鼠(SPF級)、昆明種小鼠(SPF級)均由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(軍)2012—0004。動物飼養(yǎng)地點為中國疾病預(yù)防控制中心動物房,實驗室為屏障環(huán)境,溫度20~24℃,相對濕度40 %~70%,許可證號為SYXK(京)2014-0043,實驗動物實驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3d。

        1.3實驗菌株

        Ames實驗選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌:TA97、TA98、TA100和TA102,菌株均經(jīng)過生物學(xué)鑒定合格后進行實驗。

        1.4實驗方法

        1.4.1急性經(jīng)口毒性實驗健康SD大鼠20只,雌雄各半,體重180~220g,采用最大耐受量(MTD)法。受試物給予劑量為18.0g/kg·BW,稱取受試物30.0g,加0.5%羧甲基纖維素鈉至100mL,終濃度為0.30g/mL。實驗前動物隔夜空腹(禁食16h,不限制飲水),以20.0mL/kg·BW灌胃量進行灌胃,1日3次,每次間隔4h。觀察期14d,記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

        1.4.2Ames實驗采用平板摻入法,使用鑒定合格的菌株TA97、TA98、TA100、TA102,用S9混合液作為體外代謝活化系統(tǒng)。實驗劑量為5 000、1 000、200、40、8μg/皿。稱取受試物1.0g,以0.103 MPa、20min高壓滅菌后,加滅菌DMSO定容至20mL,濃度為50 000μg/mL,作為最高劑量濃度。并設(shè)立空白對照組、溶劑對照組和陽性對照組,陽性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1,8-二羥基蒽醌和敵克松,每個組分別設(shè)3個平行皿。此實驗重復(fù)2次,若受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照組的2倍以上,且具有劑量反應(yīng)關(guān)系者則為陽性。

        1.4.3小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗選用健康昆明小鼠50只,體重25~30g,隨機分為5組,每組10只。實驗按照一次性最大灌胃劑量方法進行劑量設(shè)計,3個劑量組分別為1.50、3.00、6.00g/kg·BW,另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。采用間隔24 h兩次經(jīng)口灌胃法進行實驗,按20mL/kg·BW灌胃,第2次給予受試物6 h后頸椎脫臼處死動物,取胸骨骨髓制片。每只動物計數(shù)200個嗜多染紅細胞(PCE),計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值(PCE/NCE);并觀察1 000個PCE中含微核的細胞數(shù),統(tǒng)計微核發(fā)生率。

        1.4.4小鼠精子畸形實驗實驗選用健康性成熟雄性昆明小鼠30只,體重25~35g。按照一次性最大灌胃劑量方法進行劑量設(shè)計,3個受試物劑量組分別為1.50、3.00、6.00g/kg·BW,另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。灌胃量為20mL/kg·BW,連續(xù)5d灌胃給予受試物。實驗第35d,頸椎脫臼處死小鼠,取兩側(cè)附睪精子濾液制片、鏡檢。每只小鼠計數(shù)1 000個精子,并計算精子畸形率。

        1.4.5大鼠30d喂養(yǎng)實驗選用健康斷乳SD大鼠80只,設(shè)對照組和3個劑量組,每組20只,雌雄各半。根據(jù)樣品的人體推薦量設(shè)立3個劑量組,分別為0.41、0.81、1.62g/kg·BW。按大鼠每日100g體重進食10g飼料計算,低、中、高劑量組分別取81、162、324g的受試物添加飼料至20kg。對照組給予基礎(chǔ)飼料。實驗期間,每天觀察并記錄動物的生長狀況,每周稱1次體重,記錄每周進食量并計算食物利用率。30d 后麻醉腹主動脈取血檢測血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查。對每只大鼠進行大體解剖,對肝、腎、脾和睪丸(卵巢)進行稱重,計算臟體比。對照組和高劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸和睪丸(卵巢)進行病理組織學(xué)檢查。

        1.4.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,微核實驗采用泊松分布檢驗統(tǒng)計,精子畸形實驗采用卡方檢驗進行統(tǒng)計,大鼠30d喂養(yǎng)實驗采用方差分析,以α=0.05作為顯著性水平。

        2 結(jié)果與分析

        2.1急性毒性實驗水飛薊以18.0g/kg·BW劑量灌胃給予大鼠,14d內(nèi)未見實驗動物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況,表明水飛薊對雌、雄兩種性別的大鼠的急性毒性最大耐受劑量均大于18.0g/kg·BW。

        2.2遺傳毒性實驗

        2.2.1Ames實驗在加S9與不加S9的情況下,各實驗組在相同實驗條件下重復(fù)2次實驗,結(jié)果表明,水飛薊各劑量組的回變菌落數(shù)都沒有超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍,并且各劑量組間未出現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。因此,水飛薊對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突變作用。

        2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗與陰性對照組相比,水飛薊各劑量組嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(NCE)的百分比并未低于20%,說明在此實驗劑量下水飛薊未表現(xiàn)出細胞毒性;環(huán)磷酰胺陽性組的微核率顯著升高(P<0.01),而各劑量組的微核率并未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05),表明水飛薊對小鼠骨髓嗜多染紅細胞未產(chǎn)生致突變作用(表1)。

        2.2.3小鼠精子畸形實驗與陰性對照組相比,水飛薊各劑量組的精子畸形率未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05),而環(huán)磷酰胺陽性組與陰性對照組相比,具有顯著性差異(P<0.01),表明水飛薊對小鼠精子無致畸作用(表2)。

        2.3大鼠30d喂養(yǎng)實驗

        2.3.1生長狀況及食物利用率實驗期間,所有動物活動正常,無明顯中毒癥狀,生長發(fā)育良好。與對照組相比,各劑量組動物體重、增重、進食量和食物利用率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

        表1 小鼠骨髓細胞微核實驗結(jié)果

        表2 精子畸形實驗結(jié)果

        表3 水飛薊膠囊對大鼠體重、食物總攝入量和食物利用率的影響

        表4 水飛薊膠囊對大鼠血液學(xué)的影響

        2.3.2血液學(xué)指標(biāo)各劑量組大鼠實驗?zāi)┢谘簩W(xué)指標(biāo)與對照組比較,0.41、0.81g/kg·BW劑量組雌性大鼠嗜酸細胞百分比與對照組比較顯著升高(P<0.01),0.81g/kg·BW劑量組雄性大鼠中性細胞百分比與對照組比較顯著降低(P<0.01),但以上各指標(biāo)的差異均在本實驗室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi),且劑量組之間并無劑量反應(yīng)關(guān)系,因此上述差異無生物學(xué)意義,其余各劑量組血液學(xué)檢測結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表4、表5)。

        2.3.3血液生化指標(biāo)各劑量組大鼠實驗?zāi)┢谘荷笜?biāo)與對照組比較,0.41g/kg·BW劑量組雌性大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高(P<0.05),但此指標(biāo)的變化在實驗室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi),該指標(biāo)的升高無生物學(xué)意義。1.62g/kg·BW劑量組雌性大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯低于對照組(P<0.05),該指標(biāo)的降低無生物學(xué)意義。其余各劑量組血生化檢測結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6、表7)。

        2.3.4對大鼠臟器重和臟體比的影響各劑量組大鼠臟器重肝、脾、腎、睪丸(卵巢)及實驗?zāi)┛崭贵w重、臟體比肝/體、脾/體、腎/體、睪丸(卵巢)/體和陰性對照組比較均無顯著性差異。

        2.3.5組織病理學(xué)檢查對照組、高劑量組各有1只動物出現(xiàn)肝細胞點狀壞死,此肝臟病理學(xué)改變是動物常見自發(fā)病變,并且高劑量組的病變發(fā)生率與對照組無顯著性差異,因此該病變和受試物無關(guān)。腎、脾、胃及十二指腸、睪丸和卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯異常。因此,與對照組比較,水飛薊并未引起動物肝、腎、脾、胃及十二指腸、睪丸(卵巢)的病理學(xué)改變。

        表5 水飛薊膠囊對大鼠白細胞分類的影響

        表6 水飛薊膠囊對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

        表7 水飛薊膠囊對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

        3 討論

        近年來,已有多項研究證實,水飛薊素不僅在保護肝功能方面具有良好的療效,還可以保護心肌細胞、防治糖尿病,具有降血脂、抗腫瘤等作用[3-5]。朱淑云等[6]研究發(fā)現(xiàn),水飛薊粕對小鼠無急性毒性作用,小鼠的經(jīng)口LD50>15g/kg·BW;楊鴻武等[7]研究水飛薊膠囊的亞慢性毒性,未發(fā)現(xiàn)水飛薊膠囊具有明顯亞慢性毒性,最大未觀察到有害作用劑量為8g/kg·BW。本次實驗結(jié)果與黃凰等[8]的研究結(jié)果一致,水飛薊在急性毒性、三項遺傳毒性和亞慢性毒性等實驗中無明顯毒副作用。

        本實驗條件下,水飛薊對雌、雄大鼠的急性經(jīng)口最大耐受量(MTD)均大于18.0g/kg·BW。Ames實驗、小鼠骨髓微核實驗和精子畸形實驗結(jié)果均未見該樣品有致突變作用。大鼠30d喂養(yǎng)實驗結(jié)果顯示,實驗動物活動正常,無明顯中毒癥狀,生長發(fā)育良好,各劑量組動物體重、進食量、食物利用、血液學(xué)、血液生化學(xué)、組織病理學(xué)指標(biāo)等均未見異常。因此,在本實驗條件下水飛薊未見明顯毒副作用,為水飛薊作為保健食品的研究開發(fā)提供了重要的毒理學(xué)科學(xué)依據(jù)?!?/p>

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